3. Визначення внутрішньоплазматичних включень бактерій

3. 1. Забарвлення волютина (метахроматичних гранул) за методом Омелянського

Волютин – поліфосфат, запасна фосфор- і азотовмісна речовина, похідна нуклеїнової кислоти. Характерна його властивість – спорідненість до основних барвників і метахромазія, тобто здатність здобувати інший колір, ніж колір речовини, що забарвлює. Метод заснований на низькій розчинності волютину в кислотах.

На знежирене скло наносять тонкий мазок суспензії мікроорганізмів (наприклад, дріжджів), сушать у повітрі, фіксують над полум'ям і забарвлюють карболовим фуксином Циля. Через 0,5-1 хвилину промивають препарат водою, знебарвлюють 20-30 с 1%-ним розчином H₂SО₄, промивають, додатково 20-30 с забарвлюють метиленовим синім (1:40), промивають, промокають, наносять олію і дивляться з імерсійною системою. Гранули волютину забарвлюються в червоний колір на фоні синьої цитоплазми.

Можна забарвити фіксовані препарати 10-30 с метиленовим синім Льоффлера, потім промити препарат водою, промокнути фільтрувальним папером і розглянути з імерсією. Гранули волютину мають фіолетовий колір на фоні блакитної цитоплазми.

3. 2. Забарвлення глікогену

Глікоген – вуглевод, тваринний крохмаль. Часто він накопичується в клітинах дріжджів, бацил і забарвлюється розчином Люголя в коричневий колір. Для збагачення дріжджових кліток глікогеном їх вирощують на солодовому середовищі. Включення глікогену добре дослідити в 1-2 добових культурах Saccharomyces cereviceae і Bacillus micoides.

На чисте предметне скло наносять невелику краплю суспензії мікроорганізму і до неї додають таку ж краплю розчину йоду в йодиді калію. Зверху поміщають покривне скло, надлишок рідини видаляють фільтрувальним папером. Препарат переглядають із використанням об'єктива 40х, забарвлений фіксований мазок без покривного скла – з імерсією.

3. 3. Забарвлення гранульози

Гранульоза – вуглевод, крохмалоподібна речовина. У великій кількості накопичується в клітинах маслянокислих бактерій – Clostridium butyricum перед спороутворенням. У якості об'єкта варто скористатися накопичувальною культурою маслянокислих бактерій. Її одержують таким способом: за 3-4 доби до занять у пробірки поміщають дрібно нарізана неочищена картопля (1/3 пробірки), на кінчику ножа вносять крейду і доливають доверху водопровідною водою. Пробірку поміщають у водяну баню і нагрівають 10 хвилин із дотриманням температури 70С , потім прохолоджують і ставлять у термостат при 30 С. Для готування препарату маслянокислих бактерій беруть піпеткою краплю суспензії з придонного шару.

У невелику краплю суспензію маслянокислих бактерій додають таку ж краплю розчину Люголя, закривають покривним склом, видаляють надлишок рідини фільтрувальним папером і переглядають із використанням об'єктива 40х, забарвлений фіксований мазок без покривного скла – з імерсією.

3. 4. Забарвлення жиру

Жир міститься в клітинах практично усіх видів мікроорганізмів, особливо багато його накопичується у старій культурі. У світловому мікроскопі крапельки жиру можна виявити за більш сильним заломленням світла, ніж навколишня цитоплазма. Однак частіше для виявлення жироподібних речовин використовують ліпофільні барвники (наприклад, судан III).

Об'єкти для дослідження – старі культури дріжджів, Bacillus micoides, Bacillus megaterium.

Простий метод виявлення ліпідних гранул суданом III

На предметне скло нанести краплю дріжджової суспензії і змішати її з краплею розчину судану III. Накрити покривним склом і виконати мікроскопію з об'єктивом 40х. У полі зору мікроскопа видно рожево-червоні краплі ліпідів у безбарвній цитоплазмі.

Контрастний метод

На предметне скло наносять невелику краплю формаліну. Петлею в неї вносять культуру мікроба. Формалін убиває клітину і розпушує оболонку. Через 5 хвилин у цю же краплю додають невелику краплю метиленового синього, а після 10 хвилин краплю судану III – індикатора жироподібних речовин. Загальну краплю, що утворилася, через 5 хвилин накривають покривним склом, видаляють надлишок рідини фільтрувальним папером і виконують мікроскопію з імерсією. Цитоплазма клітин забарвлюється в синій колір, включення жиру – у рожево-жовтогарячий. У дослідженні дріжджових кліток у полі зору видно ліпідні гранули – рожеві чи жовтогарячі, блакитну цитоплазму, безбарвні вакуолі.

Результати спостережень відобразити у вигляді малюнків. Указати назву об'єкта, відзначити морфологічні особливості організмів, наявність капсул, спор, включень.

Після закінчення роботи предметні й покривні стекла з препаратами перш, ніж вимити, продезінфікувати.