Типы рестриктаз

Рестриктазы І типа: рестриктазы ЕсоВ и ЕсоК имеют три субъединицы:

S-субъединица распознает сайт рестрикции;

М-субъединица – фермент метилаза;

R-субъединица – рестриктаза.

Донором СН₃-групп для метилирования являетсяS-аденозилметионин. Сайтами узнавания для рестриктаз первого типа служат двусторонние и ассиметричные последовательности ДНК.

Рестриктазы ІІ типа (ЕсоRI,BstI,HindIII,AluI,PstIи др.) – осуществляют только рестрикцию, метилирование производит другой фермент. РестриктазыІІ типа разрезают ДНК в неметилированных палиндромных сайтах (центральная симметрия с образованием тупых или липких концов). Эти ферменты очень специфичны, используются для рестрикционного анализа ДНК, а также в генной инженерии.EcoRIимеет две идентичных субъединицы. Сайты узнавания и рестрикции совпадают.

Рестриктазы ІІІ типа‑ это рестриктазы промежуточного типа. В состав фермента входит и рестриктаза и метилаза, сайт узнавания находится неподалеку от сайта рестрикции.

Впервые рестриктазы были обнаружены у прокариот. У эукариот метилирование также происходит, но без рестрикции. Оно обеспечивает различное функциональное состояние генов. Защита от вирусов у эукариот осуществляется другим способом.

Іі. Репликационная система репарации

1. Репарация по ходу репликации

Репликационная система репарации функционирует для проверки правильности репликации. У прокариот ее осуществляют ДНК-полимераза Iи ДНК-полимеразаIIIпрямо по ходу репликации, т.к. указанные ДНК-полимеразы присоединяют следующий нуклеотид только к спаренному с матрицей предыдущему нуклеотиду.

2. Репликационная репарация после метилирования дочерней цепи

Сразу после репликации обеих цепей ДНК молекула оказывается полуметилированной,т. е. метилированы только матричные материнские цепи. Эта разница в материнских и дочерних цепях выявляется с помощью продукта генаdam,особенно в последовательности ГАТЦ (палиндром). В ней обычно метилирован аденин. Фермент генаdamметилирует А в дочерней цепи. В противном случае возникает мутация. В природе широко распространено метилирование цитозина, который потенциально мутагенен, т.к. продуктом его дезаминирования является тимин, спаривающийся с аденином. Метилированные цитозины в ЦЦГГ являются горячими точками мутагенеза, т.е способствуют закреплению мутаций.

Процесс исправления в случае некомплементарного встраивания нуклеотида осуществляется путем вырезания «неправильного» фрагмента ДНК дочерней цепи и застраивания бреши путем репарационного синтеза с использованием в качестве матрицы родительской цепи. В этом процессе участвуют продукты генов mutS, uvrDа также АТФ и дезоксирибонуклеотиды.

3. Прямая репарация

Прямая репарация включает несколько наиболее простых механизмов коррекции ДНК, которые осуществляются обычно с помощью одного репарирующего фермента. По такому механизму осуществляются прямая реактивация и прямая фотореактивация.

Прямая реактивация важна для «исправления» алкилированных (в основном метилированных и этилированных) азотистых оснований. У бактерий специальный фермент метилтрансферазаотщепляет алкильную группу от «неправильного» нуклеотида и переносит ее на свой цистеиновый остаток. В результате сам фермент инактивируется, но может служить регулятором собственного гена и некоторых других генов.

Прямая фотореактивация важна для исправления тиминовых димеров, образующихся при УФЛ-мутагенезе. Тиминовые димеры возникают под воздействием ультафиолетовых лучей за счет образования дополнительных ковалентных связей между двумя соседними тиминами в цепи ДНК. Фермент – фотолиаза (М.м.35 кД), найденный у многих бактерий, с помощью небольшого фрагмента РНК находит на поврежденной ДНК тиминовый димер, присоединяется к нему, активируется под воздействием видимого света (с длиной волны 300-600 нм) и производит «расшивание» димера. После восстановления структуры ДНК фермент отщепляется.