- •2. Характеристика процесса репликации
- •3. Гипотетические механизмы репликации.
- •4. Ферменты и белки, принимающие участие в репликации
- •Головні білки реплікації
- •5. Стадии репликации: инициация, элонгация, терминация (на примере e.Coli).
- •6.Отличия репликации у эукариот и прокариот
- •Типы репликации
- •8. Проблема репликации линейных концов днк. Теломераза.
- •Тема 2. Геномы организмов
- •Геном прокариот
- •Уcтройство генов прокариотов
- •Обозначения к схеме и пояснения
- •Тема 3: геномы эукариот
- •Тема 4: Репарация
- •Классификация систем репарации
- •Типы рестриктаз
- •Іі. Репликационная система репарации
- •1. Репарация по ходу репликации
- •2. Репликационная репарация после метилирования дочерней цепи
- •3. Прямая репарация
- •4. Эксцизионная репарация
- •Индуцированная sos-репарация
- •III. Пострепликативная репарация (рекомбинационная)
- •Тема 5: мобильные генетические элементы (мгэ)
- •Плазмиды
- •Свойства плазмид
- •Характеристика некоторых видов плазмид
- •Транспозоны
- •Мобильные генетические элементы прокариот
- •Мобильные генетические элементы эукариот
- •Тема 6: регуляция метаболизма
- •Регуляция на уровне транскрипции
- •Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции
- •Тема 7. Конструирование рекомбинантных днк (основы генной инженерии)
- •I этап. Получение генов или фрагментов днк для последующего встраивания в хромосому реципиента
- •Синтез гена химическим путем
- •Использование обратной транскриптазы
- •Метод дробовика (дробового ружья)
- •Іі этап. Конструирование рекомбинантных молекул с помощью векторов. Векторы и принципы их конструирования
- •III этап. Введение рекомбинантного вектора в клетку реципиента
- •IV этап. Клонирование рек-днк и идентификация рекомбинантных клеток
Тема 2. Геномы организмов
Геном – совокупность всех нуклеотидов хромосомы у прокариот или же совокупность всех нуклеотидов в гаплоидном наборе у эукариот. Объем генома у представителей разных царств живых организмов сильно варьирует. От объема генома и соответственно количества генов зависит степень сложности данного организма, уровень и характер проявления жизнедеятельности.
Генотип– совокупность генов организма. Понятие «геном» шире, т.к. он включает не только кодирующие последовательности - гены, но и некодирующие последовательности (особенно у эукариот).
Эволюция генетического аппарата живых организмов шла в направлении:
кодон – ген – оперон – геном вирусов и плазмид – геном прокариот (нуклеоид + мобильные генетические элементы) – геном эукариот (хромосомы + МГЭ).
Геном вирусов менее совершенен, чем у про- и эукариот, и чаще содержит нуклеиновые кислоты одного типа – одно- или двухцепочечную ДНК или же одно- или двухцепочечную РНК.
Зная массу 1 нуклеотида (500 Да) и среднюю длину гена (≈ 1000 нуклеотидов), можно примерно подсчитать, сколько генов входит в состав геномов разных организмов:
вирус гепатита В – 4 гена;
ВИЧ – 9 генов;
Фаг фХ 174 – 9 генов;
Бактериофаг Т4Е.coli– 200 генов;
F-фактор Е.coli(плазмида) – 90 генов;
хламидии – 400-600 генов;
риккетсии – 1000 генов;
Е.coli– 2500-3000 генов;
человек – 75 тыс. (возможно 100-150 тыс.) генов.
Для всех геномов клеточных организмов (про- и эукариот) характерны следующие свойства:
способность к саморепликации;
способность к самообновлению (изменчивости) за счет мутаций, рекомбинаций и транспозиций;
способность к самовыражению – экспрессии генов путем транскрипции и трансляции;
способность к самоисправлению с помощью механизмов репарации, ревизии и супрессии.
Геном прокариот
Прокариоты представлены бактериями и цианобактериями. Их геном включает нуклеотидные последовательности, входящие в состав кольцевой хромосомы, а также дополнительные элементы генома – плазмиды, транспозоны, интегроны, фаги, профаги, остатки фаговой и плазмидной ДНК.
Структура нуклеоида. Бактериальная хромосома имеет гаплоидный набор, представлена двуцепочечной ДНК, замкнутой в кольцо. У Е.coli она состоит из 5х106 п.н., ее молекулярноая масса – 2,5-3,0 х 109 Да. Бактериальную хромосому называют нуклеоидом, т.к. она не окружена ядерной мембраной, компактно уложена и в некоторых местах прикреплена к мембране (20-40 сайтов прикрепления). В ней отмечается отрицательная суперспирализация с образованием петель. При электронной микроскопии выявляется от 12 до 140 петель, которые в центре нуклеоида фиксируются особыми молекулами 4,5 S РНК, образуя сердцевинную структуру. В центре нуклеоида имеются гистоноподобные белки НU (50% всех белков нуклеоида). Однако бактериальная хромосома не имеет нуклеосом, состоящих из гистонов в отличие от эукариот. Большой отрицательный заряд ДНК, формируемый фосфатными группами, нейтрализуется ионами натрия, магния и цинка.
Деспирализованые петли лежат вдоль мембраны, так как на этих участках идёт транскрипция, а освобождающаяся и-РНК сразу поступает на рибосомы (полисомы), расположенные на мембране. Это способствует быстрой экскреции внеклеточных белков-ферментов в окружающую среду, что важно для внеклеточного переваривания сложных субстратов.
Множественность генома. Для прокариот характерна множественность генома, а именно в пределах одной клетки может существовать 4, 8, и более 40 копий одной и той же хромосомы. Такое состояние возникает из-за несбалансированности процессов репликации и деления клетки.
Деление клетки и репликация. Митоза и мейоза у прокариот нет. Размножение происходит путем простого бинарного деления, которому предшествует удвоение молекулы ДНК – репликация, осуществляемая путем синтеза дополнительной цепи. У большинства прокариот Р. двунаправленная, за исключением некоторых плазмид, однако хромосома представляет собой один репликон, т. к. имеет одинorigin– участок инициации репликации.
Почти сразу после репликации осуществляется метилирование некоторых нуклеотидов – А, Г, Ц, особенно в сайтах рестрикции. Это важно для предотвращения гидролиза собственной ДНК рестриктазами. Система ферментов, обеспечивающая этот процесс, называется системой рестрикции-модификации, и главная её функция – уничтожение всех чужеродных ДНК, проникших в клетку.
Экономность генома у прокариот проявляется в том, что они содержат мало некодирующих последовательностей – 15-20%, у человека некодирующие последовательности ДНК составляют 80-90%. Основная часть хромосомы прокариотов представлена структурными и регуляторными генами. Структурные гены кодируют синтез основных белков и ферментов, участвующих в процессах метаболизма, роста и деления клетки. Регуляторные гены кодируют синтез регуляторных белков, которые руководят процессами метаболизма путем «включения» или «выключения» генов.
Некодирующие последовательности у прокариотов представлены мультикопийными повторами, например, последовательность REP в геноме повторяется 580 раз. Последовательность ГЦТГГТГГ может повторяться на протяжении 5000 пар нуклеотидов – это последовательность для рекомбиназы rec-BCD. Среди некодирующих последовательностей в линейных хромосомах прокариотов обнаруживаются последовательности подобные теломерам эукариот. У прокариотов встречаются также генные семейства, например, у E. сoli имеются семейства оперонов, включающие гены р-РНК и т-РНК.
Что касается расположения генов на кольцевой хромосоме, то имеется следующая закономерность: гены главных функций (репликации, роста и деления) расположены ближе к origin-центруначала репликации, а гены второстепенных функций находятся дистальнее, т.е. ближе кterminus-центру– точке окончания репликации. Это важно, так как, даже если репликация не идет до конца, гены главных функций все же успевают удвоиться.