- •2. Характеристика процесса репликации
- •3. Гипотетические механизмы репликации.
- •4. Ферменты и белки, принимающие участие в репликации
- •Головні білки реплікації
- •5. Стадии репликации: инициация, элонгация, терминация (на примере e.Coli).
- •6.Отличия репликации у эукариот и прокариот
- •Типы репликации
- •8. Проблема репликации линейных концов днк. Теломераза.
- •Тема 2. Геномы организмов
- •Геном прокариот
- •Уcтройство генов прокариотов
- •Обозначения к схеме и пояснения
- •Тема 3: геномы эукариот
- •Тема 4: Репарация
- •Классификация систем репарации
- •Типы рестриктаз
- •Іі. Репликационная система репарации
- •1. Репарация по ходу репликации
- •2. Репликационная репарация после метилирования дочерней цепи
- •3. Прямая репарация
- •4. Эксцизионная репарация
- •Индуцированная sos-репарация
- •III. Пострепликативная репарация (рекомбинационная)
- •Тема 5: мобильные генетические элементы (мгэ)
- •Плазмиды
- •Свойства плазмид
- •Характеристика некоторых видов плазмид
- •Транспозоны
- •Мобильные генетические элементы прокариот
- •Мобильные генетические элементы эукариот
- •Тема 6: регуляция метаболизма
- •Регуляция на уровне транскрипции
- •Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции
- •Тема 7. Конструирование рекомбинантных днк (основы генной инженерии)
- •I этап. Получение генов или фрагментов днк для последующего встраивания в хромосому реципиента
- •Синтез гена химическим путем
- •Использование обратной транскриптазы
- •Метод дробовика (дробового ружья)
- •Іі этап. Конструирование рекомбинантных молекул с помощью векторов. Векторы и принципы их конструирования
- •III этап. Введение рекомбинантного вектора в клетку реципиента
- •IV этап. Клонирование рек-днк и идентификация рекомбинантных клеток
Тема 4: Репарация
Хотя ДНК является достаточно стабильной молекулой благодаря «сокрытию» реакционноспособных групп внутри двухцепочечной молекулы и вследствие стойкости дезоксирибозы по сравнению с рибозой, все же она подвергается изменениям под воздействием следующих факторов:
спонтанные мутации (частота 10-4–10-11), происходящие под воздействием тепловой энергии, активных метаболитов, при ошибках в работе ДНК-полимераз;
индуцированные мутации под воздействием УФЛ, ионизирующей радиации, многочисленных химических мутагенов;
рекомбинативные процессы,осуществляемые при участии мобильных генетических элементов - МГЭ (плазмид, транспозонов, вирусов).
Важную роль в исправлении повреждений ДНК, вызванных мутациями и рекомбинациями, играет репаративная система клетки, включающая целый ряд разнообразных ферментов. Репаративные ферменты могут действовать точечно, исправляя локальные мутации (прямая репарация, фотореактивация), а могут и удалять достаточно крупные участки поврежденной ДНК (эксцизионная репарация, темновая репарация). Образовавшиеся при этом делеции застраиваются с использованием неповрежденной матричной цепи при участии репликативных ферментов. В случае особо мощного воздействия мутагенов включаетсяSOS-индуцированная репарация, которая призвана сохранить ДНК любой ценой, даже допуская ошибочное встраивание нуклеотидов.
Классификация систем репарации
І. Система модификации и рестрикции у бактерий
ІІ. Репликационная репарация – коррекция ДНК с помощью ДНК-полимераз и др. ферментов по ходу репликации.
ІІІ. Пострепликационная репарация (в основном рекомбинационная) – исправления повреждений в уже синтезированной ДНК.
Рассмотрим эти типы репараций.
І. МR-система (система рестрикции-модификации)
МR-система у бактерий представлена двумя типами ферментов:метилазами и рестриктазами и направлена на уничтожение чужеродной ДНК, проникающей в клетку извне или же на ДНК, образующуюся в результате спонтанных внутренних мутаций.
Метилазыметят метильными группами аденин и цитозин в определенных участках собственной ДНК – «горячих точках» рестрикции. Горячими точками рестрикции являются обычно небольшие палиндромы – участки ДНК, в которых относительно условной точки симметрии в транс-положении имеются инвертированные повторы, т.е. одинаковые, но повернутые относительно друг друга на 1800, например:
АА Г Г Ц А Т Г Ц Ц Т Т
Т Т Ц Ц Г Т А Ц Г Г А А
Рис. 4.1. Пример палиндрома (стрелкой обозначена условная ось симметрии, относительно которой цепи повернуты на 180О в транс-положении)
Рестриктазы в этих же сайтах («горячих точках» рестрикции) могут разрезать ДНК, если она не метилирована. Эта система защиты направлена прежде всего на проникающую в клетку чужеродную ДНК (в основном фаговую). Метилазная и рестриктазная активности могут принадлежать одному белку, а могут – двум разным белкам. Метилирование «своей» ДНК в специфических сайтах предотвращает ее от разрушения собственными рестриктазами. Действием метилаз можно объяснить появление в ДНК минорных азотистых оснований – 5-метилцитозина и 6-метиламинопурина. Они появляются сразу после репликации.
Сейчас известно более 400 микробных рестриктаз, которые распознают приблизительно 100 сайтов рестрикции. Рестриктазы могут разрезать ДНК с образованием «тупых» концов, т.е. с образованием равных фрагментов ДНК в месте гидролиза. Другие рестриктазы могут образовывать «липкие» концы, т.е. разрезают сайт рестрикции со смещением и образованием выступа в одной цепи разрыва и пробела – в другой цепи. Образованные липкие концы комплементарны друг другу. Это свойство рестриктаз широко используется в генной инженерии для встраивания генов в векторы – плазмиды, транспозоны, вирусы и др.
ААТТА---------------АЦТАТААТТ ААТТАА--------------ЦТАТААТТ
ТТААТТГАТ----------------АТТАА ТТААТТ--------------ГАТАТТАА
Рестрикция ДНК с образованием Рестрикция ДНК с образованием
«липких концов» «тупых» концов»
Рис. 4.2. Схема гидролиза ДНК рестриктазами с образованием
«липких» и «тупых» концов