Головні білки реплікації

Білок	Кодуючий його ген	Функція
Білок-ініціатор РНКаза-Н	dna A mh	Ініціація реплікації, зв’язування з оріджином та його часткове розплітання. Забезпечення вибірковості ініціації реплікації.
Гіраза (топоізомераза ІІ) (2 субодиниці А та В) Топоізомераза І	gyr A, gyr B top A	Перевірка цілісності ДНК перед реплікацією шляхом негативної суперспіралізації хромосоми. Розплітання суперпетель завдяки двохнитковим розривам ДНК. Усунення просторових проблем при реплікації кільцевих ДНК. Участь в розплітанні дволанцюгової ДНК завдяки однонитковому розриву в кільцевій хромосомі в акті ініціації.
Хелікази: Rep-білок Dna B (6 білків) Dna C (6 білків)	rep dna B dna C	Здійсюють розплітання дуплексу ДНК за рахунок руйнування водневих зв’язків між комплементарними нуклеотидами. Полегшують утворення хелікази Dna В на відстаючому ланцюзі.
Праймаза	dna G	Здійснює синтез праймерів – РНК-ових затравок на відстаючому ланцюзі.
SSB-білки: (тетрапептиди) 19 кДа кожен	ssb (single strand binding)	Запобігання ренатурації ДНК, витягування та «очистка» однониткових ДНК
ДНК-полімераза ІІІ, холофермент включає субодиниці: Α Β Γ Δ Ε Θ Τ М.м холоферменту – 500 кДа	dna E dna N dna Z dna X dna Q	Головний фермент реплікації, синтезує дочірній ланцюг на ведучому та ферменти Оказакі на відстаючому ланцюгах. Полімерізуюча активність. АТФазна активність 3/-eкзонуклеазна активність
ДНК-полімераза І: Більший фрагмент (фрагмент Кльонова) м.м. 109 кДа Менший фрагмент	pol A	Видалення праймерів та забудова виломів у відстаючому ланцюзі. Полімерізуюча та 3/-екзонуклеазна активність 5/-eкзонуклеазна активність
ДНК-лігаза	lig	З’єднання фрагментів Оказакі фосфодиефірним зв’язком
ДНК-залежна АТФ-аза N n/ n// i		Входить до складу праймосоми

5. Стадии репликации: инициация, элонгация, терминация (на примере e.Coli).

У большинства организмов репликация осуществляется как двунаправленный процесс. У некоторых бактериальных плазмид и вирусов может происходить однонаправленная репликация по типу разворачивающегося рулона или катящегося кольца. В репликации так же, как и в процессах транскрипции и трансляции выделяют три основные стадии: инициацию, элонгацию и терминацию. Рассмотрим процесс репликации на примере Е.coli.

Инициацияначинается с проверки ДНК на целостность путем отрицательного суперскручивания с помощью ДНК-гиразы. Если в ДНК есть хоть 1 разрыв, суперскручивание не происходит и необходима репарация ДНК. Для перевода ДНК в релаксированное состояние (это важно для раскручивания), гираза делает двуцепочечные разрывы в ДНК и распутывает петли. Далее белок-инициатор (dnaA) прикрепляет богатую АТ-парами область ориджина к выросту ЦПМ. Топоизомераза 1 делает одноцепочечный разрыввблизи oriC, прикрепляется к 5^/-концу разрыва, а 3^/-конец начинает раскручиваться относительно интактной цепи с образованиями репликативной вилки, где и происходит сборка ферментативного аппарата репликации.

На лидирующей цепинеспецифическая РНК-полимераза осуществляет синтез небольшого РНК-вого транскрипта, к которому в дальнейшем ДНК-полимеразаІІІбудет присоединять ДНК-овые нуклеотиды (если транскрипт образовался в «неправильном» месте, РНК-аза Н гидролизует его обеспечивая избирательность синтеза). Перед транскриптом на цепь ДНК «садится» хеликазаrepиSSBбелки. Последние удерживают разведенные цепи ДНК, не давая им ренатурировать, а также убирают случайные элементы с матричной цепи ДНК. Далее к цепи присоединяется ДНК-полимеразаIII.

На отстающей цепиформируется сложная хеликаза-dnaBdnaCпутем последовательного присоединения 6 белковdnaCи 6 белков -dnaB. Сюда же присоединяются белкиn, n^/, n^//,iи праймаза. Формируется сложная частица –праймосома, которая в комплексе с ДНК-полимеразойІІІобразуетреплисому. На эту цепь также «садятся»SSBбелки. Перед началом элонгации на каждой цепи оказывается по 1 молекуле ДНК-полимеразыIII.

Элонгацияосуществляется по-разному на лидирующей и отстающей цепях.

На лидирующей– идет непрерывный синтез цепи ДНК, путем последовательного присоединения нуклеотидов к РНК-транскрипту. Предшественники синтеза ДНК – активированные 3-фосфонуклеозиды. От 3-фосфонуклеозида отщепляется пирофосфат, а оставшийся 5^/-фосфорнокислый конецприсоединяется к 3^/-гидроксилу предыдущего нуклеотида. Синтезидет внаправлении 5^/-3^/.

На отстающей цеписначала праймазы синтезируют РНК-овые праймеры – затравки, к которым ДНК-полимеразаIIIприсоединяет последовательно ДНК-овые нуклеотиды с образованием фрагментов Оказаки (по 1000-2000 нуклеотидов каждый). В результате дочерняя цепь ДНК становится фрагментарной и состоит из чередующихся РНК-овых затравок и ДНК-овых фрагментов Оказаки. Для перевода всей цепи на язык ДНК, к процессу подключается ДНК-полимеразаI, которая с помощью своей 3^/-экзонуклеазной активности убирает РНК-овые праймеры, а с помощью полимеризующей активности застраивает образующиеся бреши ДНК-овыми нуклеотидами. Все ДНК-овые фрагменты сшиваются лигазой.

Так как матричные цепи ДНК антипараллельны, то синтез дочерних цепей идет в разном направлении, однако репликативная вилка, включающая все ферменты, движется синхронно в направлении разведения матричных цепей. Оказалось, что это возможно благодаря образованию на отстающей цепи петли (в месте расположения ферментов), которая скользит по ходу репликации вдоль ДНК. Проблема антипараллельности цепей решается за счет поворота последовательности ДНК в петле на 180º. Перед движущейся репликативной вилкой происходит кручение молекулы ДНК со скоростью 6 тыс. об/мин, при этом в молекуле образуются спутанные петли. В их расплетании важную роль играют топоизомеразы.

Терминация.При двунаправленном синтезе репликация начинается вoriC, а заканчивается в терминус-центре (terminusC) . Вилки, движущиеся навстречу, как бы сбивают друг друга. При однонаправленной репликации процесс начинается и заканчивается вoriC. Вновь образовавшаяся ДНК прикрепляется к выросту ЦПМ и, за счет локального синтеза мембраны 2 молекулы ДНК разводятся к полюсам клетки. Они могут оказаться сцепленными, т.е. образуютсякатенаны (синонимкатемеры). В их рассоединении участвуют гираза и топоизомеразаI. После образования межклеточной перегородки между двумя молекулами ДНК формируются 2 новые дочерние клетки.

Процессинг. Сразу после репликации во вновь образованной ДНК в сайтах (участках) рестрикции происходит метилирование аденина, гуанина и цитозина. Это необходимо для мечения собственной ДНК и предотвращения разрезания ДНК в этих сайтах собственными рестриктазами (эндонуклеазами). Сама по себе система рестрикции нужна для направленного уничтожения чужеродной ДНК (например, вирусной), проникающей в клетку.