4. Ферменты и белки, принимающие участие в репликации

Репликация – это процесс матричного синтеза, так же как транскрипция и трансляция. Он высококоординирован и обслуживается большим количеством ферментов и белков (более 30). Изучены гены, кодирующие эти продукты. Они обозначаются: dna A, dna B, dna C, dna D, dna E, dna I, dna L, dna M, dna N и т.д.Кроме этих генов есть еще гены со специфическими названиями: lig (ген лигазы), rep (ген хеликазы лидирующей цепи), gir A, gir B (гены гиразы), top (гены топоизомераз). Рассмотрим основные белки и ферменты, принимающие важное участие в процессе репликации.

1. Белок-инициатор – продукт гена dna A, узнаёт на ДНК точку начала репликации - origin center (ori C). Это участок на хромосоме с достаточно большой протяженностью - несколько сотен нуклеотидов, насыщенный АТ-парами, в котором легко могут расходиться цепи; у Е.coli при двунаправленной репликации он имеет протяженность – 440 нуклеотидов, при однонаправленной репликации – 245 нуклеотидов.

2. РНКаза-Н – обеспечивает избирательность начала репликации. Если по какой-то причине репликация началась не в ori C, то РНКаза-Н гидролизует образующуюся в неправильном месте затравочную цепь.

3. Топоизомеразы (продукты генов top) – ферменты, обеспечивающие пространственные превращения ДНК перед началом репликации и в процессе ее, способствует расплетанию и распутыванию ДНК перед репликацией. У Е.coli существует две топоизомеразы - top 1 и top 2.

Топоизомераза 2 (top 2) или гираза – фермент, который обладает 2-мя функциями: 1-я функция – гираза обеспечивает проверку целостности ДНК путем отрицательного суперскручивания. Если в ДНК имеется хоть 1 разрыв, то суперскручивание не будет происходить; 2-я функция – прямо противоположная - гираза делает в ДНК двухцепочечный разрыв и, протаскивая часть запутанной ДНК через разрыв, расплетает петли ДНК. Налидиксовая кислота и антибиотики группы фторхинолонов (норфлоксацин, офлоксацин, ципрофлоксацин и др.) являются ингибиторами гиразы и используются, как лекарственное средство, при бактериальных инфекциях, т.к. блокирование top 2 полностью прекращает репликацию и деление клетки.

Топоизомераза 1 (top 1) осуществляет одноцепочечный разрыв ДНК, присоединяется к 5^/-концу разрыва, а 3`-конец начинает вращаться и раскручиваться относительно интактной цепи (неповрежденной). Т.о. возникает репликативная вилка.

4. Хеликазы – ферменты, разрывающие водородные связи между азотистыми основаниями комплементарных цепей. На лидирующей цепи работает хеликаза-rep, которая использует 2 молекулы АТФ на разрыв одной пары нуклеотидов. На отстающей цепи работает более сложная хеликаза dnaCdnaB, состоящая из 6 белков гена dna C и 6 белков гена dna B. Вспомогательную роль играют белки n, n^/, n^//, i. Белок n` обладает АТФ-азной активностью, т.е. обеспечивает хеликазу энергией.

5. Праймаза – фермент, обеспечивающий синтез небольших РНК-овых затравок - праймеров, с которых начинается впоследствии синтез ДНК.

Хеликаза dnaBdnaC, белки n, n^/, n^//, i, а также праймаза образуют сложную частицу – праймосому на отстающей цепи.

6. SSB-белки (от англ. single strand binding) – тетрамеры из 4 одинаковых субъединиц (М.м. каждой – 19 кДа), связываются с разведенными одиночными материнскими цепями ДНК, скользят по ним перед репликативной вилкой, убирая все случайные элементы, т.е. как бы «чистят» матрицы, не дают цепям ДНК ренатурировать (соединяться).

7. ДНК-полимеразы различны у эукариотов и прокариотов.

У прокариот выделяют 3 типа ДНК-полимераз:

1) ДНК-полимераза І – фермент с молекулярной массой - 109 кДа. В процессе ограниченного протеолиза фермент делится на 2 фрагмента: фрагмент Кленова (больший; используется в генной инженерии) и меньший фрагмент.

Фрагмент Кленова обладает двумя ферментативными активностями - полимеризующей, т. е. ведет синтез ДНК-овой цепи в направлении 5^/-3^/, а также 3^/-экзонуклеазной активностью, т.е. способен отщеплять нуклеотиды с 3^/-конца.

Меньший фрагмент ДНК-полимеразы обладает 5^/-экзонуклеазной активностью и способен выщеплять неверные нуклеотиды с 5^/-конца.

ДНК-полимераза I при репликации ДНК на стадии элонгации осуществляет вырезание РНК-овых праймеров и замену их на ДНК-овые последовательности. Этот фермент играет важную роль не только в репликации, но и в репарации.

2) ДНК-полимераза ІІ – фермент с молекулярной массой – 120 кДа, состоит из одной субъединицы, обладает теми же активностями, что и фрагмент Кленова, т.е. полимеризующей и 3^/-экзонуклеазной. В клетке его приблизительно в 4 раза меньше, чем ДНК-полимеразы I (около 100 молекул). Этот фермент может дублировать функции ДНК-полимеразы I и так же играет роль в репарации.

3) ДНК-полимераза ІІІ – главный фермент репликации. Ведет синтез ДНК на лидирующей цепи непрерывно, на отстающей цепи – в пульсирующем ритме, а именно, в противоположном направлении синтезирует отдельные ДНК-овые фрагменты (фрагменты Оказаки). Молекулярная масса фермента – 500 кДа. Он состоит из 7 субъединиц: α, β, γ, δ, ε, θ, τ. Действует в виде холорфермента - полного комплекса всех субъединиц. Кофактором ДНК-полимеразы ІІІ считаются ионы Mg²⁺ и Zn²⁺. Для некоторых субъединиц фермента установлены ферментативные активности, а именно:

α-субъединица – полимеризующая активность;

β-субъединица – АТФ-азная активность;

ε-субъединица – 3^/-экзонуклеазная активность.

Фермент работает с высокой точностью (допускается не более 1 ошибки на 10⁹ нуклеотидов) и с высокой скоростью (у прокариот – 1000-1600 нуклеотидов в секунду).

8.. ДНК-полимеразы эукариот делят на α-, β-, γ-, δ- полимеразы:

1. α-полимераза – молекулярная масса – 500 кДа, имеет 4 субъединицы. Обладает полимеризующей активностью и праймазной. Это главный фермент репликации у эукариот.

2. β-полимераза - молекулярная масса – 40 кДа. Обладает полимеризующей активностью и играет роль в репарации.

3. γ-полимераза - молекулярная масса – 50 кДа, имеет несколько субъединиц, обладает полимеризующей активностью, осуществляет синтез ДНК митохондрий.

4. δ-полимераза - молекулярная масса – 120-150 кДа, имеет 2 субъединицы, обладает полимеризующей и 3`-экзонуклеазной активностями (убирает праймеры).

9.. Лигаза – фермент, осуществляющий сшивку фрагментов ДНК путем образования фосфодиэфирной связи между 3^/-гидроксильным концом и 5^/-фосфатным концом. У прокариот кофактором лигазы является НАД, у эукариот и фагов – АТФ.