Добавил:
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
Молекулярная биология (лекции).doc
Скачиваний:
152
Добавлен:
15.10.2018
Размер:
896 Кб
Скачать

ЛЕКЦИИ

по курсу “Молекулярная биология”

Доц. каф. микробиологии и вирусологии

Соколова Ирина Евгеньевна

Тема 1. Репликация (синтез ДНК)

План

1. Молекулярные механизмы важнейших процессов клетки.

2. Характеристика процесса репликации.

3. Гипотетические механизмы репликации.

4. Ферменты и белки, принимающие участие в репликации.

5. Стадии репликации: инициация, элонгация, терминация (на примере E.coli).

6. Отличия репликации у эукариот и прокариот.

7. Тип репликации.

8.Проблема репликации линейных концов ДНК. Теломераза.

1. Молекулярные механизмы важнейших процессов клетки.

Помимо изучения структуры и функции ДНК, в задачи молекулярной биологии входит изучение сложнейших механизмов клетки на молекулярном уровне. К таким механизмам относят:

  • репликация – синтез ДНК, обеспечивающий воспроизведение генетической информации;

  • экспрессия генов– перевод информации с ДНК на белок, сначала путем транскрипции, а затем – трансляции на рибосомах;

  • регуляция экспрессии генов с использованием различных механизмов: позитивного и негативного контроля, индукции и репрессии, аутогенного контроля, катаболитной репрессии, аттенуации и др.;

  • процессы изменчивости генов:молекулярные механизмы мутации, рекомбинации, транспозиции;

  • репарация - восстановление повреждений ДНК, приобретенных в результате мутаций, рекомбинаций, транспозиций (прямая репарация, эксцизионная,SOS-индуцированная, пострепликативная и др. виды репарации).

В последние годы одними из важнейших задач молекулярной биологии стали: изучение генома человека и др. организмов, исследование рака, механизмов старения, апоптоза (запрограммированной гибели клетки), СПИДа, наследственных заболеваний, взаимодействия вируса и клетки-хозяина и др.

2. Характеристика процесса репликации

Репликация– это сложный процесс копирования (удвоения) ДНК, который обеспечивается генами самой ДНК. Репликация играет важную роль в прохождении таких процессов, как репарация, рекомбинация и транспозиция. Даже существование вирусов было бы не возможно без удвоения их нуклеиновых кислот. От слаженности этого процесса в конечном итоге зависит продолжительность жизни всех организмов.

3. Гипотетические механизмы репликации.

В 1953г. Уотсон и Крик, сразу после создания модели ДНК, высказали предположение, что удвоение ДНК должно происходить путем разрыва водородных связей между двумя комплементарними цепями, и при этом каждая цепь является матрицей для синтеза новой дочерней цепи. При делении клетки надвое, в каждую половинку попадает ДНК, состоящая из 1 старой и 1 новой цепи. Такой механизм репликации называется полуконсервативным. Учеными было предложено на рассмотрение еще 2 других гипотетических механизма репликации:консервативный и диспересивный. Встречаются значительно реже.

Консервативный механизмпредполагал следующее: на одной из материнских цепей осуществляется синтез дочерней цепи, а образованная дочерняя цепь служит матрицей для синтеза еще одной дочерней цепи. Но после деления клетки в одну половинку попадает 2 старых цепи ДНК, а в другую – 2 новых. Этот механизм довольно случаен и почти не встречается в природе, т.к. невыгоден из-за возможного накопления мутаций в половине клеток популяции.

Дисперсивный механизм: подразумевал возможность рекомбинаций. После такой репликации в дочерних клетках должны оказаться ДНК, состоящие из фрагментов старого и нового материала (у эукариот это происходит в результате кроссинговера, но не репликации).

В 1957 г. Мезелсон и Сталь экспериментально доказали наличие у Е.coliполуконсервативного механизма репликации.

4. Ферменты и белки, принимающие участие в репликации

Репликация – это процесс матричного синтеза, так же как транскрипция и трансляция. Он высококоординирован и обслуживается большим количеством ферментов и белков (более 30). Изучены гены, кодирующие эти продукты. Они обозначаются: dnaA,dnaB,dnaC,dnaD,dnaE,dnaI,dnaL,dnaM,dnaNи т.д.Кроме этих генов есть еще гены со специфическими названиями:lig(ген лигазы),rep(ген хеликазы лидирующей цепи),girA,girB(гены гиразы),top(гены топоизомераз). Рассмотрим основные белки и ферменты, принимающие важное участие в процессе репликации.

  1. Белок-инициатор– продукт генаdnaA, узнаёт на ДНК точку начала репликации -origin center (ori C). Это участок на хромосоме с достаточно большой протяженностью - несколько сотен нуклеотидов, насыщенный АТ-парами, в котором легко могут расходиться цепи; у Е.coliпри двунаправленной репликации он имеет протяженность – 440 нуклеотидов, при однонаправленной репликации – 245 нуклеотидов.

  2. РНКаза-Нобеспечивает избирательность начала репликации. Если по какой-то причине репликация началась не вoriC, то РНКаза-Н гидролизует образующуюся в неправильном месте затравочную цепь.

  3. Топоизомеразы (продукты геновtop)– ферменты, обеспечивающие пространственные превращения ДНК перед началом репликации и в процессе ее, способствует расплетанию и распутыванию ДНК перед репликацией. У Е.coliсуществует две топоизомеразы -top1 иtop2.

Топоизомераза 2 (top 2) или гираза– фермент, который обладает 2-мя функциями: 1-я функция – гираза обеспечивает проверку целостности ДНК путем отрицательного суперскручивания. Если в ДНК имеется хоть 1 разрыв, то суперскручивание не будет происходить; 2-я функция – прямо противоположная - гираза делает в ДНК двухцепочечный разрыв и, протаскивая часть запутанной ДНК через разрыв, расплетает петли ДНК. Налидиксовая кислота и антибиотики группы фторхинолонов (норфлоксацин, офлоксацин, ципрофлоксацин и др.) являются ингибиторами гиразы и используются, как лекарственное средство, при бактериальных инфекциях, т.к. блокированиеtop2 полностью прекращает репликацию и деление клетки.

Топоизомераза 1 (top 1) осуществляет одноцепочечный разрыв ДНК, присоединяется к 5/-концу разрыва, а 3`-конец начинает вращаться и раскручиваться относительно интактной цепи (неповрежденной). Т.о. возникает репликативная вилка.

  1. Хеликазы – ферменты, разрывающие водородные связи между азотистыми основаниями комплементарных цепей. На лидирующей цепи работаетхеликаза-rep, которая использует 2 молекулы АТФ на разрыв одной пары нуклеотидов. На отстающей цепи работает более сложнаяхеликаза dnaCdnaB, состоящая из 6 белков генаdnaCи 6 белков генаdnaB. Вспомогательную роль играют белкиn, n/, n//, i. Белокn` обладает АТФ-азной активностью, т.е. обеспечивает хеликазу энергией.

  2. Праймаза – фермент, обеспечивающий синтез небольших РНК-овых затравок -праймеров, с которых начинается впоследствии синтез ДНК.

Хеликаза dnaBdnaC, белкиn, n/, n//, i, а также праймаза образуют сложную частицу – праймосому на отстающей цепи.

  1. SSB-белки(от англ.singlestrandbinding) – тетрамеры из 4 одинаковых субъединиц (М.м. каждой – 19 кДа), связываются с разведенными одиночными материнскими цепями ДНК, скользят по ним перед репликативной вилкой, убирая все случайные элементы, т.е. как бы «чистят» матрицы, не дают цепям ДНК ренатурировать (соединяться).

7. ДНК-полимеразы различны у эукариотов и прокариотов.

У прокариот выделяют 3 типа ДНК-полимераз:

1) ДНК-полимераза І – фермент с молекулярной массой - 109 кДа. В процессе ограниченного протеолиза фермент делится на 2 фрагмента: фрагмент Кленова (больший; используется в генной инженерии) и меньший фрагмент.

Фрагмент Кленоваобладает двумя ферментативными активностями -полимеризующей,т. е. ведет синтез ДНК-овой цепи в направлении 5/-3/, а также3/-экзонуклеазнойактивностью, т.е. способен отщеплять нуклеотиды с 3/-конца.

Меньший фрагмент ДНК-полимеразы обладает 5/-экзонуклеазнойактивностью и способен выщеплять неверные нуклеотиды с 5/-конца.

ДНК-полимераза I при репликации ДНК на стадии элонгации осуществляет вырезание РНК-овых праймеров и замену их на ДНК-овые последовательности. Этот фермент играет важную роль не только в репликации, но и в репарации.

2) ДНК-полимераза ІІ – фермент с молекулярной массой – 120 кДа, состоит из одной субъединицы, обладает теми же активностями, что и фрагмент Кленова, т.е.полимеризующей и 3/-экзонуклеазной.В клетке его приблизительно в 4 раза меньше, чем ДНК-полимеразыI(около 100 молекул). Этот фермент может дублировать функции ДНК-полимеразыIи так же играет роль в репарации.

3) ДНК-полимераза ІІІ – главный фермент репликации. Ведет синтез ДНК на лидирующей цепи непрерывно, на отстающей цепи – в пульсирующем ритме, а именно, в противоположном направлении синтезирует отдельные ДНК-овые фрагменты (фрагменты Оказаки). Молекулярная масса фермента – 500 кДа. Он состоит из 7 субъединиц: α, β, γ, δ, ε, θ, τ. Действует в виде холорфермента - полного комплекса всех субъединиц. Кофактором ДНК-полимеразыІІІсчитаются ионыMg2+иZn2+. Для некоторых субъединиц фермента установлены ферментативные активности, а именно:

α-субъединица – полимеризующая активность;

β-субъединица – АТФ-азная активность;

ε-субъединица – 3/-экзонуклеазная активность.

Фермент работает с высокой точностью (допускается не более 1 ошибки на 109нуклеотидов) и с высокой скоростью (у прокариот – 1000-1600 нуклеотидов в секунду).

8.. ДНК-полимеразы эукариот делят на α-, β-, γ-, δ- полимеразы:

  1. α-полимераза– молекулярная масса – 500 кДа, имеет 4 субъединицы. Обладает полимеризующей активностью и праймазной. Это главный фермент репликации у эукариот.

  2. β-полимераза- молекулярная масса – 40 кДа. Обладает полимеризующей активностью и играет роль в репарации.

  3. γ-полимераза - молекулярная масса – 50 кДа, имеет несколько субъединиц, обладает полимеризующей активностью, осуществляет синтез ДНК митохондрий.

  4. δ-полимераза - молекулярная масса – 120-150 кДа, имеет 2 субъединицы, обладает полимеризующей и 3`-экзонуклеазной активностями (убирает праймеры).

9.. Лигаза– фермент, осуществляющий сшивку фрагментов ДНК путем образования фосфодиэфирной связи между 3/-гидроксильным концом и 5/-фосфатным концом. У прокариот кофактором лигазы является НАД, у эукариот и фагов – АТФ.