Журнал неврологии и психиатрии / 2009 / NEV_2009_04_09

ферментных механизмов, а при их неэффективности — путем элиминации дефектных клеток посредством апоптоза [7, 21]. Содержание активных форм кислорода также находится под контролем белка р53, кодируемого геном p53 [13].

В последние годы внимание исследователей привлекает изучение полиморфных генов при заболеваниях человека. Для некоторых из них установлена связь их полиморфизма с возникновением патологии. Это прежде всего гены ферментов, участвующих в поддержании оксидантного статуса организма: супероксиддисмутаз (СОД) — митохондриальной (Mn-СОД) и внеклеточной (ВК-СОД) [18, 30], глутатион-S-трансфераз (GST) [35], обладающих прямой антиоксидантной активностью против реакционноспособных метаболитов генотоксических ксенобиотиков, включая лекарственные препараты [36]. Показан высокий риск развития легочной аденокарциномы у лиц, имеющих полиморфные гены детоксикации GSTM1, CYP1A1 и CYP2E1 [37]. Обнаружена связь полиморфных генов серотонин- и дофаминергической систем у пациентов с шизофренией [3].

Далее, это ген метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR)

— центрального фермента обмена фолиевой кислоты, контролирующего синтез предшественников нуклеиновых кислот. У женщин в возрасте до 35 лет в момент зачатия полиморфизм гена MTHFR 677C→T в сочетании с недостаточностью фолиевой кислоты в питании во время беременности, создавая дефицит тимидилового нуклеотида для синтеза ДНК, увеличивает риск аномалии развития плода в направлении синдрома Дауна [19]. Наконец, это полиморфизм гена р53, ответственного за синтез белка 53 — опухолевого супрессора, выполняющего надзорную функцию за постоянством генома. Мутационные изменения в этом гене приводят к полиморфизму генных продуктов, часть из которых неизбежно приводит к формированию определенных заболеваний [23, 25, 38].

Как уже отмечалось, некоторые из рассмотренных выше генов системы поддержания стабильности генома (кроме генов СОД, MTHFR и фрагментарно р53) при синдроме Дауна до сих пор не изучали. Не проводилось комплексное изучение их как системы, и не исследовался вклад этих генов в радиочувствительность.

Целью исследования явилось изучение полиморфизма генов CYP1A1 (I фаза), GSTM1, GSTT1, GSTP1 (II фаза детоксикации) и MTHFR, а также наличия мутационных изменений в гене р53 у пациентов с синдромом Дауна.

Материал и методы

У 18 пациентов с синдромом Дауна (с подтвержденным диагнозом трисомии по хромосоме 21) и 61 ребенка из группы контроля (сходных по этническому составу) брали по 3 мл венозной крови (на эту процедуру было получено информированное согласие государственного опекуна).

ДНК выделяли из лимфоцитов периферической крови с помощью наборов Diatom DNA Prep (лаборатория «Изоген»), применяя в качестве лизирующего реагента гуанидин-тиоцианат «Nucleos-сорбент». Условия амплификации фрагментов исследуемых генов фазы I (CYP1A1) и II детоксикации (GSTM1, GSTT1, GSTP1), а также гена MTHFR с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР), нуклеотидные последовательности использованных праймеров, а также примеры полученных электрофореграмм описаны ранее [5, 6].

Мутации гена р53 определяли при помощи технологии ПЦРанализа конформационного полиморфизма одной нити ДНК (PCR-SSCP) в экзоне 7, содержащем кодоны 246—250 («мутационные горячие точки» этого гена). Амплификацию экзона 7 проводили путем полимеразной цепной реакции, как в работе [20] с некоторыми модификациями. Для увеличения чувствительности метода, обычно выявляющего мутации только, если доля мутантных аллелей от присутствующих в пробе аллелей дикого типа составляет не менее 5%, проводили повторную амплификацию материала в присутствии синтезированного PNA (пептида нуклеи-

новой кислоты), предложенного в работе [12], специфически связывающегося только с неповрежденными кодонами и ингибирующего их амплификацию, но не препятствующего амплификации мутировавших кодонов. Эта процедура позволяет на порядок увеличить чувствительность метода и обнаруживать присутствие 0,5% мутаций в области упомянутых «горячих точек» экзона (в нашем случае 7, содержащего кодоны 246—250). Состав используемых конъюгатов пептид-нуклеиновых кислот (PNA) и праймеров соответствовал работе [12]. В реакционную смесь как при первой, так и при второй амплификациях радиоактивные нуклеотидтрифосфаты не прибавляли. К 9 мкл раствора синтезированного полинуклеотида прибавляли 36 мкл денатурирующего раствора, содержащего 95% формамида, 10 ммоль/л NaOH, 0,05% бромфенолового синего и 0,05% ксилолцианола и инкубировали при температуре 95°С в течение 3 мин. По окончании инкубации пробы сразу наносили на электрофорезный гель для SSCPанализа.

Электрофорез экзона 7 осуществляли по ранее описанному методу [9].

Электрофорез продуктов, полученных после двух амплификаций, проводили в течение 16 ч в 10% полиакриламидном геле следующего состава: 15,0 мл 30% маточного раствора акриламида и бисакриламида (29:1), 4,5 мл 50% глицерина, 22,75 мл Н2О, 450 мкл 10% раствора персульфата аммония, 50 мкл ТЕМЕД, 2,25 мл трисборатного буфера. Условия электрофореза: напряжение 120 В, сила тока 45 мА, температура +4°C. Фрагменты анализируемой ДНК на геле проявляли при помощи красителя SYBRGold, приготовленного по протоколу фирмы-производителя, видеоизображения электрофореграмм записывали с помощью компьютеризированной видеосистемы Gel Imager. Интерпретацию результатов проводили путем сравнения пробега фрагментов анализируемых и контрольных образцов.

Для статистической обработки результатов использовали непараметрические критерии: точный критерий Фишера и тест Т. Шеллинга—Вольфейля [8].

Результаты и обсуждение

Данные по изучению частоты различных вариантов пяти полиморфных генов — CYP, GSTM1, GSTP1, GSTT1, MTHFR в лимфоцитах пациентов с синдромом Дауна представлены в табл. 1 и 2.

Как видно из приведенных данных, отношение частот генотипов по гену CYP1А1 варианта (А/А) к варианту (А/G) в обследованных группах в контроле и у пациентов с синдромом Дауна различается. Однако несмотря на более чем двукратное различие, оно недостоверно (р<0,23).

Аналогичное соотношение вариантов (0/0) и (+) по гену GSTM1 в контроле составило 37:47, т.е. 0,78, у пациентов с синдромом Дауна — 50:33, т.е. 1,5, свидетельствуя о почти двукратном превышении относительной частоты варианта GSTM1 (0/0) над аналогичной частотой варианта (+) (р<0,038) при болезни Дауна.

В обследованной группе пациентов с синдромом Дауна в гене GSTP1 обнаружено достоверное изменение соотношения частот А/А к G/G (р<0,0027) и А/G к G/G (p<0,0093) по сравнению с наблюдавшимся в контроле.

Что касается соотношения вариантов (0/0) и (+) генотипа GSTT1, то у пациентов с синдромом Дауна хотя и выявлено меньшее значение этого отношения (3,0) по сравнению с величиной, наблюдавшейся у детей контрольной группы (4,7), но различие между этими величинами было статистически недостоверным (р>0,1).

Следует подчеркнуть, что частота встречаемости делеций по гену GSTM1 в контрольной популяции составила 40—50%, однако в зависимости от этнической принадлежности она может снижаться до 25%, например у афроамериканцев [4].

Отношение частот генотипов по гену MTHFR между вариантами (С/С) и (Т/Т) в группе пациентов с синдромом Дауна было выше, чем в контрольной, однако эти различия были статистически не значимыми (р=0,2). Различие в соотношении вариантов С/С и С/Т можно рассматривать как имеющее тенденцию к достоверному (р<0,072).

Таким образом, по частотам вариантов изученных генотипов по генам GSTM1 и GSTP1 очевидно некоторое отличие обследованной группы пациентов с синдромом Дауна от контрольных лиц. Патогенетическую значимость выявленных отличий еще предстоит оценить в последующем.

В табл. 2 представлены данные по частотам индивидов с гомо/гетерозиготными генотипами по нормальному аллелю всех изученных генов глютатион-S-трансфераз (GSTM1, GSTP1, GSTT1) в группе контроля, а также у пациентов с синдромами Элерса—Данло (ЭД) и Дауна. Из табл. 2 видно достоверное уменьшение числа детей с нормальными аллелями всех трех изученных генов глютатион- S-трансфераз при синдроме Дауна по сравнению как с контрольной группой, так и с группой пациентов с синдромом ЭД. Синдром ЭД был исследован нами по этим генам ранее [5, 6]. Для этого синдрома, как и для синдрома Дауна, характерна повышенная радиочувствительность клеток. Клетки пациентов с синдромом ЭД (наследственное заболевание, при котором нарушен обмен соединительнотканных элементов) дефектны по репарации γ-индуцированных повреждений ДНК. При этом синдроме было отмечено увеличение частоты генотипов GSTM(+), GSTP1 (val/val) по сравнению с контролем. Это свидетельствует о возможном компенсаторном функционировании одной защитной системы (в данном случае — GST) при дефекте другой (пониженная активность репарации ДНК).

Возможно, мутантный генотип GSTP1 (val/val) в сочетании с нормальным генотипом GSTM(+) обусловливают повышенную активность соответствующих этим генам ферментов, направленную на нейтрализацию свободных радикалов (уровень которых повышен при синдроме ЭД). В результате происходит снижение количества индуцируемых радикалами повреждений ДНК, а следовательно, уменьшение нагрузки на системы репарации ДНК. Это согласуется с данными о вкладе GSTM1 в формирование хромосомных аберраций, число которых всегда выше у лиц с GSTM(–) генотипом [4].

При синдроме Дауна, когда (это видно из полученных данных) наблюдается некоторое уменьшение нормальных аллелей всех изученных GST генотипов, возможно, что компенсаторную функцию в отношении нейтрализации свободных радикалов выполняет супероксиддисмутаза, уровень которой при этом синдроме всегда повышен [2].

На рис. 1 представлены электрофореграммы, полученные при использовании технологии полимеразной цепной реакции — анализа конформационного полиморфизма одной нити ДНК (SSCP-анализ) с целью обнаружения точковых мутаций в экзоне 7 гена р53. Данный экзон содержит «мутационно горячие точки» кодонов 246— 250 этого гена, являющиеся особо чувствительными к действию продуктов перекисного окисления липидов [23, 38], образующихся при действии активных форм кислорода. Анализу подвергали пробы периферической крови 11 пациентов с синдромом Дауна и 17 здоровых доноров. Проведение SSCP-анализа экзона 7 гена р53 в указанных пробах путем однократной амплификации (обеспечивающей ограниченную чувствительность методики обнаружения мутаций), не привело к выявлению полос, которые бы свидетельствовали о наличии мутаций в исследуемом материале как от здоровых доноров, так и пациентов с

синдромом Дауна (см. рис. 1). При дальнейшем анализе материала проб при помощи повторной амплификации с использованием PNA, применяемых для повышения чувствительности метода, обнаружено (рис. 2), что электрофореграммы проб ДНК от пациентов 1, 3, 8 и 10 с синдромом Дауна отличаются от электрофореграмм ДНК здоровых доноров появлением дополнительных полос, свидетельствующих о наличии мутаций в области «мутационных горячих точек» кодонов 246—250 экзона 7 гена р53.

Таким образом, ни у одного из 17 здоровых доноров, пробы ДНК которых были подвергнуты ПЦР-SSCP- анализу как грубым методом с однократной полимеризацией, так и высокочувствительным — с использованием PNA, не было обнаружено мутационных изменений в экзоне 7 гена р53. В то же время у 4 из 11 пациентов с синдромом Дауна (пациенты 1, 3, 8 и 10) выявлены мутации в том же экзоне, содержащем «мутационно горячие точки» кодонов 246—250 гена р53. Выявленные различия являются статистически высокозначимыми (р<0,008).

Обнаружение возникновения мутаций в «горячих точках» гена р53, чувствительных к повреждающему действию активных форм кислорода в клетках пациентов с синдромом Дауна, находящихся в состоянии длительного оксидативного стресса, свидетельствует об увеличенном риске формирования у этих лиц онкогематологической патологии. Данные по распределению исследуемых генотипов у детей с синдромом Дауна и здоровых, а также генотипов по нормальным аллелям (гены GST) представлены в табл. 1 и 2.

Ранее мутации в гене p53 при синдроме Дауна были обнаружены у пациентов с уже сформировавшимися клиническими картинами рака молочной железы с метастазами [14], мегакариоцитарного лейкоза [27, 29]. Полагают, что возникновение мутаций в гене р53 при онкозаболеваниях не детерминируют онкотрансформацию, поскольку наблюдаются с частотой в среднем до 30% для всех случаев развития этой патологии [1]. При миелобластном лейкозе, развившемся у пациентов с трисомией 21-й хромосомы, процент больных с мутациями в гене р53 более высокий [29]. Поскольку обнаружение мутаций в гене р53, несомненно, служит показателем риска возможного развития онкологического заболевания, полученные нами результаты о возникновении мутаций в экзоне 7 у 4 пациентов с синдромом Дауна могут иметь важное практическое значение для выработки рациональной стратегии клинического ведения этих лиц.

В этой ситуации, безусловно, важной является оценка состояния полиморфных генов, кодирующих ферменты антиоксидантной защиты, включая изученную систему ферментов детоксикации, участвующих в поддержании стабильности генома. Действительно, исследования клеток легочного эпителия у больных раком легкого показали, что повреждение гена р53 в «мутационных горячих точках» может зависеть от полиморфизма генов детоксикации [10]. Наибольший уровень повреждений генома у курильщиков наблюдался при генотипе CYPIAI-2/2 (функционально высокоактивный) и GSTM1-0/0 [11, 33]. В нашем исследовании связи между повреждением гена р53 в «мутационных горячих точках» и генотипом GSTM1-0/0 не выявлено. У 2 пациентов (3-го и 8-го) с мутацией в гене р53 такой генотип присутствовал, у 2 других (1-го и 10-го) — нет. Не исключено, что эти результаты обусловлены малой выборкой, подвергнутой изучению, и

Рис. 1. Распределение интенсивности свечения окрашенных продуктов амплификации экзонов 7 гена р53 из ДНК проб периферической крови пациентов с синдромом Дауна после однократного электрофореза в полиакриламидном геле.

М — маркер молекулярного веса; к15, к16, к17 — номера доноров; д1, д3, д8, д9, д10 — пациентов синдромом Дауна; – – — отрицательные контроли PCR-SSCP анализа (вода вместо пробы ДНК).

Рис. 2. Распределение интенсивности свечения продуктов амплификации фрагментов ДНК, окрашенных красителем «Sybr Gold», содержащих кодоны 246—250 гена р53 из проб периферической крови пациентов с синдромом Дауна 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 и доноров №№ к1, к2, к3, к4 после электрофореза в полиакриламидном геле.

М — маркер молекулярного веса; – — отрицательный контроль PCRSSCP анализа (вода вместо проб ДНК). Стрелки показывают расположение дополнительных полос на электрофореграмме, свидетельствующих о наличии мутаций в исследуемых кодонах.

накопление исследовательского материала следует продолжить.

В заключение необходимо отметить, что обнаружение особенностей состояния генов, изученных в настоящей работе при синдроме Дауна, может иметь в дальнейшем большое значение для пренатальной диагностики и определения риска рождения детей с этим синдромом у матерей, характеризующихся определенным генотипом. На практическую важность совершенствования такого рода диагностики указывает то, что каждая из 150 оплодотво-

ренных яйцеклеток имеет трисомию по 21-й хромосоме, и всего 80% из них элиминируются на ранних стадиях беременности [22].

Можно полагать также, что развитие знаний по вопросу о состоянии полиморфных генов поддержания стабильности генома при синдроме Дауна будет способствовать разработке новых рациональных подходов к тактике

ЛИТЕРАТУРА

1.Бартновский А.Е. и др. Методологические особенности ПЦР-анализа гена р53 в ДНК плазмы и клеток крови онкологических больных. Клин лаб диагн 2003; 11: 19—23.

2.Бочков Н.П. Клиническая медицина. М: Гэотар-Мед 2004; 1—475.

3.Голимбет В.Е., Лебедева И.С., Грещенко И.К. и др. Связь полиморфизма генов серотонинергической и дофаминергической систем с вызванными потенциалами у больных шизофренией и их родственников. Журн неврол и психиат 2005; 105: 35—411.

4.Засухина Г.Д., Кузьмина Н.С. и др. Генетический полиморфизм в защите клеток человека от мутагенов. В кн.: Молекулярный полиморфизм человека. M: РУДН 2007; 583—599.

5.Кузьмина Н.С., Васильева И.М, Засухина Г.Д. и др. Полиморфизм генов глютатион-S-трансфераз и нарушение репарации ДНК. Радиобиология. Радиоэкология 2006; 4: 424—428.

6.Кузьмина Н.С., Шипаева Е.В., Засухина Г.Д. и др. Полиморфизм генов детоксикации и устойчивость клеток к воздействию мутагенов у пациентов с синдромом Элерса—Данло. Бюл эксп биол и мед 2007; 11: 500—504.

7.Мазурик В.К., Мороз Б.Б. Проблемы радиобиологии и белок р53. Радиационная биология. Радиоэкология 2001; 41: 5: 548—572.

8.Малета Ю.С., Тарасов В.В. Непараметрические методы статистического анализа в биологии и медицине. М: МГУ 1982; 178.

9.Михайлов В.Ф., Мазурик В.К., Надежина Н.М. и др. Исследование молекулярных проявлений нестабильности генома у лиц, подвергавшихся воздействию ионизирующей радиации в клинически значимых дозах. Радиац. биология. Радиоэкология 2006; 46: 3: 322—336.

10.Чердынцев Н.В., Севостьянова Н.В., Флеминг М.В. и др. Полиморфизм генов глутатион-S-трансфураз у больных раком легкого: связь с опухолевой прогрессией. Молекулярная медицина 2006; 46—52.

11.Alexandrov K., Cascorbi I. et al. Carcinogenesis 2002; 23: 12: 1696—1977.

12.Behn M., Schuermann M. Sensitive detection of p53 gene mutations by a mutant enriched PCR-SSCP technique. Nucl Acids Res 1998; 26: 5: 1356—1358.

13.Bensaad K., Vousden K.H. p53: new roles in metabolism. Trends Cell Biol 2007; 17: 6: 286—291.

14.Bernardino J. et al. Unusual clonal chromosomal evolution in a breast carcinoma and its lymph node metastasis in a patient with Down syndrome. Genes Chromosomes Cancer 1997; 19: 3: 195—199.

15.Busciglio J., Andersen J., Schipper H. et al. Stress, Aging and Neurodegenerative disorders: Molecular mechanisms. Annals N.Y. Acad Sci 1998; 851: 429—443.

16.Busciglio J., Plesman A., Wong C. et al. Altered metabolism of the amyloid beta precursor protein is associated with mitochondrial dysfunction in Down’s syndrome. Neuron 2002; 33: 5: 677—688.

17.Casado A., López-Fernández M.E., Ruíz R. Lipid peroxidation in Down syndrome caused by regular trisomy 21, trisomy 21 by Robertsonian translocation and mosaic trisomy 21. Clin Chem Lab Med 2007; 45: 1: 59—62.

18.Chistyakov D.A. et al. Polymorphisms in the Mn-SOD and EC-SOD Genes and Their Relationship to Diabetic Neuropathy in Type 1 Diabetes Mellitus. Med Genet 2001; 2: 4—11.

19.Coppede F., Colognato R., Bonelli A. et al. Polimorfizms in folate and homocysteine metabolizing genes and hromosome damage in mothers of Down syndrome children. Am J Med Yenet Ass 2007; 143: 2006—2015.

20.Gealy R., Zhang L., Siegfried J.M. et al. Comparison of Mutations in the p53 and K-ras Genes in Lung Carcinomas from Smoking and Nonsmoking Women. Cancer Epidemiol Biomarks Prevent 1999; 8: 298—302.

лечения пациентов и применения лекарственных препаратов, используемых при этом синдроме, с учетом особенностей генотипа пациентов.

Работа выполнена по грантам «Фундаментальные вопросы медицины», РФФИ.

21.Hang J., Sengupta R., Espeio A. et al. P53 is regulated by the lysine demethylase LSDI. Nature 2007; 499—453.

22.Hobbs C., Sherman S., Yi P. et al. Polimorphisms in genes involved in folate metabolism as maternal risk factors for Down Syndrome. Am J Hum Yenet 2000; 67: 623—630.

23.Hu W., Feng Z., Eveleigh J. et al. The major lipid peroxidation product, trans-4-hydroxy-2-nonenal, preferentially forms DNA adducts at codon 249 of human p53 gene, a unique mutational hotspot in hepatocellular carcinoma. Carcinogenesis 2002; 23: 11: 1781—1789.

24.Huang T.T., Mantha S., Epstein C.J. The role of oxidative imbalance in the pathogenesis of Down syndrome. In: J. Fuchs, M. Podda, L. Packer (eds.). Redox Genome Interactions in Health and Disease. New York: Dekker 2003; 409—424.

25.Hussain S.P., Raja K., Amstad P.A. et al. Increased p53 mutation load in nontumorous human liver of Wilson disease and hemochromatosis: oxyradical overload diseases. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97: 12770—12775.

26.Iannello R.C., Crack P.J., de Haan J.B., Kola I. Oxidative stress and neural dysfunction in Down syndrome. J Neural Transm Suppl 1999; 57: 257— 267.

27.Kanezaki R., Toki T., Xu G. et al. Cloning and Characterization of the Novel Chimeric Gene p53/FXR2 in the Acute Megakaryoblastic Leukemia Cell Line CMK11-5. Tohoku J Exper Medicine 2006; 209: 3: 169—180.

28.Lane D.P. Cancer. p53, guardian of genome. Nature 1992; 352: 6381: 15— 16.

29.Malkin D., Brown E.J., Zipursky A. The role of p53 in megakaryocyte differentiation and the megakaryocytic leukemias of Down syndrome. Cancer Genet Cytogenet 2000; 116: 1: 1—5.

30.Martin R.C.G., Ahn J., Nowell S.A. et al. Association between manganese superoxide dismutase promoter gene polymorphism and breast cancer survival. Breast Cancer Res 2006; 8: 4: R45.

31.Monte D. Molecular abnormalities of the brain in Down syndrome: relevance to Alzheimer’s neurodegeneration. J Neural Nransm Suppl 1999; 57: 1—19.

32.Perrone S., Longini M., Bellieni C.V.et al. Early oxidative stress in amniotic fluid of pregnancies with Down syndrome. Clin Biochem 2007; 40: 3—4: 177—180.

33.Rom W.N., Hay J.G. et al. Fm J Res Crit Care Med 2000; 161: 4: 1355— 1367.

34.Saran N.G., Pletcher M.T., JoAnne E. et al. Global disruption of the cerebellar transcriptome in a Down syndrome mouse model. Human Mol Genetics 2003; 12: 16: 2013—2019.

35.Wahner A.D. et al. Glutathione S-transferase mu, omega, pi, and theta class variants and smoking in Parkinson’s disease. Neurosci Lett 2007; 413: 3: 274—278.

36.Wang J., Deng Y., Li L. et al. Association of GST M1, CYP1 A1 and CYP2 E1 genetic polymorphism with susceptibility to lung adenocarcinoma. Cancer Sci 2003; 94: 448—452.

37.Xiulian Sun, Yigang Tong, Hong Qing et al. Increased BACE1 maturation contributes to the pathogenesis of Alzheimer’s disease in Down syndrome. FASEB J 2006; 20: 1361—1368.

38.Yao-Yuan Hsieh, Chich-Sheng Lin. P53 codon 11, 72 and 248 gene polymorphisms in endometriosis. Int J Biol Sci 2006; 2: 4: 188—193.