Журнал неврологии и психиатрии / 2006 / NEV_2006_12_09

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ

превалированием лихорадочной и стертой форм клещевого энцефалита (92,5%), снижением заболеваемости менингеальной до 4,6% и паралитическими до 2,9% [2]. Кроме того, внедрение в практическое здравоохранение новых высокочувствительных серологи- ческих методов верификации диагноза этой инфекции показало, что в настоящее время имеется оче- видная тенденция к возрастанию числа случаев регистрации пациентов, у которых после острого периода инфекции или без него в крови длительное время определяется антиген вируса клещевого энцефалита без клинических проявлений. Острое (до 6 мес) и хроническое (свыше 6 мес) бессимптомное носительство антигена вируса клещевого энцефалита встречается в десятки и сотни раз чаще клинически диагностируемых случаев [2]. Их исходом могут быть, с одной стороны, выздоровление, а с другой — переход в манифестную или хроническую (прогредиентную) форму. Учет бессимптомной антигенемии вируса клещевого энцефалита имеет важное практическое зна- чение, так как позволяет правильно оценить эпидемиологическую обстановку, прогноз исхода инфицирования этим вирусом, а также происхождение иммунных нарушений у лиц, длительно проживающих в природном очаге.

Как известно, ключевым звеном в механизмах развития длительной персистенции вируса в организме является дисфункция иммунокомпетентных клеток — главного эффектора в отношении вирусной агрессии и в то же время мишени для действия вируса. Свидетельством тому может служить изоляция штаммов вируса из лейкоцитов крови больных клещевым энцефалитом и лиц с жалобами на присасывание иксодовых клещей. Успешное выделение вируса в первые дни после присасывания клеща служит проявлением адсорбции и размножения вируса непосредственно в иммунокомпетентных клетках периферической крови человека [8]. Лейкоциты являются универсальной пермиссивной системой для размножения этого вируса, поскольку относятся к числу иммунонеприкосновенных систем. Дальнейший ход инфекционного процесса предопределяется результатом взаимодействия вируса и клетки-хозяина и зависит как от вирулентности возбудителя, определяемой совокупным действием его факторов патогенности, так и антиинфекционного потенциала хозяина, имеющего в своей основе функциональные возможности иммунокомпетентных клеток.

Принято считать, что вирус клещевого энцефалита оказывает прямое цитопатическое действие, вызывающее цитолиз и клиренс инфицированных клеток. В этих условиях отмечается активация клеток Т-эффекторной и фагоцитарной систем иммунитета, которые являются основными продуцентами цитокинов, регулирующих запуск, направление и реализацию противовирусного иммунного ответа [9, 11—14]. Ключевыми активаторами неспецифических клеточ- ных реакций иммунитета и регуляторами эффекторов в иммунном ответе служат продуцируемые моноцитами/макрофагами и лимфоцитами цитокины и в частности интерферон γ (ИФН-γ), фактор некроза опухолей α (ФНО-α) и интерлейкин-12 (ИЛ-12) [1, 5, 6, 15, 17, 18, 20]. В настоящее время накоплено

достаточно данных, позволяющих приблизиться к пониманию молекулярных механизмов противовирусного действия цитокинов. Рядом исследователей выявлены значительные изменения системы цитокинов при различных острых вирусных инфекциях, в том числе при клещевом энцефалите [10, 12—14]. Так, установлено, что манифестация его лихорадочной формы сопровождается возрастанием продукции мононуклеарными лейкоцитами ФНО-α и ИФН-γ [11, 12, 14], изменением продукции ИФН-γ и оксида азота [14]. Однако до сих пор не оценена роль изменений продукции ИФН-γ, а также ФНО-α и ИЛ-12, являющихся ключевыми цитокинами в реализации противовирусного иммунитета, в механизмах формирования длительного носительства вируса клещевого энцефалита. Это и стало предметом настоящего исследования.

Материал и методы

В программу исследования были включены 55 пациентов (32 мужчины и 23 женщины) в возрасте от 18 до 45 лет (средний 37±7 лет) с антигенемией вируса клещевого энцефалита в эпидемические сезоны 2002—2003 гг. Обследованных разделили на три клинические группы. В первую были включены 23 че- ловека с острой антигенемией вируса клещевого энцефалита (до 6 мес). Вторую составили 17 пациентов

ñего длительной (более 6 мес) антигенемией, у которых имелась остаточная клиническая симптоматика. Вошедшие в две указанные группы перенесли манифестную лихорадочную форму заболевания средней тяжести; в остром периоде они находились на стационарном лечении в специализированных лечебных учреждениях. Третья группа включала 15 человек

ñдлительной (более 6 мес) бессимптомной персистенцией антигена вируса клещевого энцефалита, что указывало на присасывание клеща в анамнезе (субклиническая форма).

Диагноз устанавливали на основании эпидемиологических данных (присасывание или обнаружение ползающих клещей), указаний на инкубационный период, ранних клинических признаков (острое на- чало, общеинфекционный синдром). Он был верифицирован путем выявления антигена вируса клещевого энцефалита в клеще и крови пациентов с использованием иммуноферментного анализа (ИФА), реакции непрямой гемагглютинации, а также специфических антител классов IgM и IgG к антигену вируса (ИФА) и РНК вируса с помощью полимеразной цепной реакции. Кровь брали в первой группе с острой антигенемией в первый день госпитализации до проведения терапии, во второй (хроническая антигенемия) — через 6 мес после выписки из стационара, в третьей — через 6 мес длительного выявления в крови вируса клещевого энцефалита.

Критериями исключения из исследования являлись наличие инфекционных заболеваний, обострений хронических болезней, аллергических заболеваний, алкогольная и наркотическая зависимость пациентов.

Клиническая картина при острой антигенемии вируса клещевого энцефалита характеризовалась ги-

пертермией разной степени — от 37,2 до 39,6°C длительностью от 3 до 7 дней. Заболевшие предъявляли жалобы на головную боль, общую слабость, тошноту, мышечные и суставные боли разной локализации, сонливость, снижение настроения. Отмечались явления менингизма без воспалительных изменений в спинномозговой жидкости, но со значительным повышением внутричерепного давления. В клиниче- ской картине острого периода инфекции доминировали нарушения со стороны вегетативной нервной системы — дистальный гипергидроз, стойкий красный дермографизм и лабильность артериального давления. У пациентов обнаруживалась рассеянная неврологическая симптоматика в виде легкого центрального пареза мимических мышц, неравномерности кожных и глубоких рефлексов, непостоянных симптомов орального автоматизма, нарушения конвергенции и болезненности точек выхода тройничного нерва. В 2 случаях определялись непостоянные патологические стопные рефлексы. Выявленная пирамидная недостаточность нервной системы указывала на минимальное вовлечение в патологический процесс вещества головного мозга. После нормализации температуры клиническая симптоматика редуцировалась.

У пациентов с длительной (более 6 мес) антигенемией вируса и минимальной клинической симптоматикой в анамнезе было указание на эпизод манифестной лихорадочной формы заболевания средней степени тяжести. На момент обследования большинство из них отмечали периодическое появление головной боли, особенно к концу рабочего дня и после любой эмоциональной или физической нагрузки, быструю утомляемость, повышенную раздражительность, бессонницу, снижение памяти и инициативы, снижение производственных навыков и частую смену настроения. При тщательном неврологическом обследовании у пациентов были выявлены рассеянные органические микросимптомы типа анизорефлексии с непостоянными знаками орального автоматизма, гиперестезии в конечностях, выраженные вегетативные расстройства в виде повышенной потливости, стойкого красного дермографизма и гипергидроза дистальных отделов конечностей.

Пациенты с субклинической формой клещевого энцефалита во время обследования жалоб не предъявляли, со стороны неврологического и соматического статуса какой-либо патологии выявлено не было.

Контрольная группа из 20 практически здоровых доноров, отрицающих факт присасывания клеща, была сопоставима с основными по полу и возрасту.

Исследовали стабилизированную гепарином (25 ЕД/мл) венозную кровь, взятую утром до приема пищи.

Концентрацию ИФН-γ, ФНО-α и ИЛ-12 определяли в супернатантах культур мононуклеаров. Выделенные на градиенте плотности Ficoll—Paque («Pharmacia», Швеция) мононуклеарные клетки (2·106/мл) культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 0,3 мг/мл L-глутамина, 10 мМ HEРES («Flow», Великобритания), 100 мкг/мл гентамицина и 5% СО2 в течение 24 ч. Продукцию цитокинов стимулировали добавлением в среду фитогемагглютини-

ИММУНОЛОГИЯ КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА

на (ФГА) («Difco», Германия). Содержание ИФН-γ, ФНО-α и ИЛ-12 в супернатантах оценивали с помощью твердофазного ИФА в соответствии с инструкцией, прилагаемой производителем тест-систем («Cytimmune», США; «Procon», Россия). Оптическую плотность растворов регистрировали на микропланшетном фотометре Multiskan EX («ThermoLabSystems», Финляндия). Концентрацию ИФН-γ, ФНО-α и ИЛ-12 рассчитывали по калибровочной кривой.

Для проверки нормальности распределения показателей использовали критерий Колмогорова— Смирнова; равенство выборочных средних проверяли по t-критерию Стъюдента (в случае нормального распределения) и U-критерию Манна—Уитни (при отклонении распределения от нормального). Корреляционный анализ проводили путем вычисления коэффициента Спирмана r.

Результаты и обсуждение

Инициация и реализация эффектов факторами неспецифической резистентности и основными бел- ками-регуляторами системного специфического иммунитета при нейроинфекциях сопряжены с действием про- и противовоспалительных цитокинов. Цитокины инициируют местный иммунный ответ и иммунное воспаление, которые ведут к повреждению нервной ткани при клещевом энцефалите, опосредующему очаговую специфическую симптоматику и определяющему прогноз заболевания.

Исследование способности мононуклеарных лейкоцитов периферической крови продуцировать иммуноцитокины у пациентов с манифестной лихорадочной формой инфекции выявило увеличение базальной и стимулированной ФГА in vitro продукции, а также индекса стимуляции ИФН-γ (табл. 1). У пациентов с длительной персистенцией вируса клещевого энцефалита в организме способность мононуклеарных лейкоцитов секретировать ИФН-γ изменялась разнонаправленно. Так, в случае длительного бессимптомного носительства вируса (субклиническая форма) отмечалось достоверное снижение конституциональной и индуцированной ФГА in vitro способности мононуклеаров синтезировать ИФН-γ по сравнению с аналогичным показателем у здоровых людей. Концентрация ИФН-γ в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов у пациентов с длительной персистенцией вируса клещевого энцефалита и наличи- ем на момент обследования минимальной клиниче- ской симптоматики превышала показатель у здоровых доноров и пациентов с субклинической формой заболевания, однако оказалась достоверно ниже, чем при острой форме заболевания (см. табл. 1). Обращал на себя внимание тот факт, что индекс стимуляции продукции ИФН-γ мононуклеарными клетками периферической крови у пациентов с хронической антигенемией вируса клещевого энцефалита оказался сниженным по сравнению с аналогичным показателем как у здоровых людей, так и у больных, обследованных в остром периоде (манифестная лихорадоч- ная форма болезни), что, вероятно, может свидетельствовать об истощении резервного потенциала клеток, опосредующего противовирусный иммунитет.

В современной литературе приводятся многочисленные результаты исследований системы интерферонов при вирусных заболеваниях. Их продукция определяет неспецифическую иммунорезистентность организма человека, направленную против вирусов. Эти иммуноцитокины подавляют ранние события репликационного цикла вируса: вызывают стереохимические изменения клеточных рецепторов вирусов и тем самым нарушают их взаимодействие с вирусными частицами. В итоге под действием интерферонов отменяются процесс вирусной адсорбции на клеточных рецепторах и последующая внутриклеточная репликация вирусов. Кроме того, интерфероны вызывают активацию макрофагов, без чего фагоцитоз вирусов малоэффективен, носит незавершенный характер, не заканчивается разрушением вирусных нуклеиновых кислот и тем самым приводит к длительной персистенции вирусов в организме.

Классическая схема регуляции активации и эффектов интерферонов при вирусной инфекции вклю- чает ряд событий, приводящих к экспрессии специфических генов: синтезированный интерферон секретируется в межклеточное пространство, связывается с поверхностными рецепторами соседних клеток, вызывая активацию экспрессии так называемых ИФН-стимулируемых генов. Их продукты являются посредниками антивирусного и других биологических эффектов ИФН. Однако регуляторные взаимоотношения в системе вирус — ИФН имеют сложный характер. Показано, что транскрипция многих цитокинстимулируемых генов может прямо модулироваться вирусами независимо от синтеза и действия ИФН [1, 15, 20]. При этом прямая индукция этих генов вирусами способна обеспечить более быстрый клеточный ответ, чем их стимуляция через вирусиндуцированный ИФН. Это может иметь решающее значение в развитии противовирусной резистентности в ранней стадии инфекции до того момента, когда инфициро-

ванные клетки начнут синтезировать эндогенный ИФН.

Известно, что многие вирусы индуцируют также специфические эволюционно выработанные механизмы «ускользания» от иммунного надзора, позволяющие им преодолевать защитное противовирусное действие интерферонов, что, несомненно, играет важную роль в патогенезе вирусных инфекций. Возможно, именно эти механизмы могут лежать в основе модулирования направления иммунного ответа при инфицировании организма человека вирусом клещевого энцефалита и определять дальнейший исход инфекционного процесса (выздоровление, длительное вирусоносительство, хронические формы заболевания). Действительно, согласно результатам настоящего исследования, нарушения продукции ИФН-γ, свидетельствующие о дизрегуляции противовирусного иммунитета, сопоставимы с выраженностью клини- ческой картины заболевания: очевидное преобладание продукции ИФН-γ у пациентов с острой и хронической антигенемией вируса клещевого энцефалита и клиническими проявлениями нейроинфекции (причем значительно выраженное в остром периоде заболевания) и снижение таковой у пациентов с длительным бессимптомным носительством этого вируса.

Современные исследования в области патофизиологии иммунного ответа демонстрируют возможность дизрегуляции цитокиновой сети и соответственно модулируемых ею защитных реакций макроорганизма. Так, для реализации противовирусного иммунитета и индукции синтеза ИФН-γ клетками-продуцен- тами, например Тh, необходимо сочетание двух сигналов: контакта с макрофагами через адгезивные молекулы и действия регуляторных цитокинов — ИЛ12, ФНО-α [5, 15, 18].

Значительный интерес к изучению продукции мононуклеарными лейкоцитами ФНО-α определяет-

ся плейотропностью эффектов данного цитокина, нарушение синтеза которого имеет фундаментальное значение в реализации иммунного ответа, развитии воспаления, тканевой деструкции и повреждении органов при различных заболеваниях. Проведенное нами исследование продукции цитокинов лейкоцитами периферической крови у пациентов с персистенцией вируса клещевого энцефалита выявило возрастание спонтанной продукции ФНО-α при его манифестной лихорадочной форме. По всей видимости, увеличенный синтез ФНО-α можно рассматривать как иммунорегуляторный механизм, способствующий активации адгезии, фагоцитоза, продукции цитокинов, фактор костимуляции для Т-клеточной активации и стимуляции антителообразования В-клетками, определяющий степень развития провоспалительных реакций в организме. Однако у пациентов с длительной персистенцией вируса характер синтеза ФНО-α имел противоположную тенденцию: спонтанный уровень продукции мононуклеарами ФНО-α не изменялся, однако стимуляция клеток ФГА in vitro приводила к угнетению способности клеток продуцировать изучаемый цитокин (табл. 2).

Таким образом, проведенные нами исследования показали, что усиление синтеза ФНО-α мононуклеарными лейкоцитами периферической крови пропорционально степени активности патологического процесса и выраженности клинической симптоматики нейроинфекции.

Продукция ИЛ-12 мононуклеарными лейкоцитами периферической крови, напротив, не изменялась у пациентов с острой формой инфекции, но достоверно возрастала в случае длительной персистенции вируса как при бессимптомной форме заболевания,

так и при наличии минимальных признаков нейроинфекции (см. табл. 2).

Возможно, выявленные закономерности нарушения продукции ИЛ-12 при разных вариантах течения клещевого энцефалита определяются тем, что в ответ на воспаление у пациентов с острой лихорадоч- ной формой одновременно с ИЛ-12, но в значительном избытке по сравнению с ним макрофагами продуцируются естественные его антагонисты р40 и гемодимер (р40)2. Показано, что продукция их достаточно продолжительное время остается высокой, в то время как уровень ИЛ-12 быстро снижается [15]. Следует особо подчеркнуть установленный нами факт регистрации у пациентов с длительным бессимптомным носительством вируса клещевого энцефалита отрицательных корреляций между продукцией ИФН-γ и ИЛ-12 при положительной корреляции уровня продукции изучаемых цитокинов у здоровых людей (r=–0,694, p<0,05 и r=0,835, p<0,05 соответственно), что, возможно, свидетельствует о дизрегуляции продукции цитокинов вследствие нарушения сложной цепи цитокиновых взаимоотношений в результате длительной антигенной стимуляции вируса клещевого энцефалита. Кроме того, одним из важных условий, обеспечивающиx реализацию эффектов цитокинов, является совпадение включения секреции цитокинов и усиления экспрессии их рецепторов на клет- ках-мишенях. Не исключено, что именно на ингибицию экспрессии генов рецепторов, в частности ИФН- γ-R, ФНО-α-R и ИЛ-12-R, направлено действие вируса клещевого энцефалита.

Таким образом, как свидетельствуют полученные нами данные, клещевой энцефалит сопровождается нарушением цитокинпродуцирующей функ-

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ

ции мононуклеарных лейкоцитов периферической крови, что, несомненно, расширяет современные представления об иммунопатогенезе этого заболевания. Кроме того, нами обнаружены закономерности изменения направления и интенсивности иммунного ответа в зависимости от степени выраженности клинической симптоматики и длительности персистенции вируса клещевого энцефалита в организме. Так, изменения продукции ИФН-γ и ФНО-α были ассоциированы со степенью активности патологи- ческого процесса и выраженностью клинической симптоматики нейроинфекции, а секреция ИЛ-12, напротив, изменялась пропорционально длительности персистенции вируса в организме и не зависела

от клинической картины заболевания. Выявленный нами характер цитокинопосредованной модификации межклеточной кооперации иммунокомпетентных клеток, несомненно, вносит вклад в изучение механизмов формирования длительной персистенции вируса клещевого энцефалита и может явиться предпосылкой для вскрытия молекулярных основ резистентности организма человека к клещевой вирусной инфекции, особенностей ее течения и повышения эффективности диагностики.

Исследование выполнено при поддержке Совета по грантам Президента Российской Федерации для поддержки ведущих научных школ Российской Федерации ¹НШ-1051.2003.4.

ЛИТЕРАТУРА

1.Бажан С.И. Молекулярно-генетические аспекты индукции и противовирусного действия интерферона. Вестн РАМН 1998;

8:18—24.

2.Жукова Н.Г. Клещевой энцефалит (этиология, эпидемиология, клиника, диагностика, лечение, профилактика). Томск 1999.

3.Злобин В.И., Горин О.З. Клещевой энцефалит. Новосибирск: Наука 2003.

4.Иерусалимский А.П. Клещевой энцефалит. Новосибирск 2001.

5.Кашкин К.П. Иммунологические исследования в клинике инфекционных заболеваний. Новости иммунол и аллергол 2004;

8:1—10.

6.Кетлинский С.А., Калинина Н.М. Цитокины мононуклеарных фагоцитов в регуляции реакции воспаления и иммунитета. Иммунология 1995; 3: 30—44.

7.Кондратьев В.П. Эпидемическая ситуация по клещевому энцефалиту. Мед паразитол и паразитарн бол 1998; 1: 52—53.

8.Леонова Г.Н., Майстровская О.С. Антигенемия у людей, инфицированных вирусом клещевого энцефалита. Вопр вирусол 1996;

5:224—228.

9.Маянский А.Н., Бурков А.Н. и др. Персистенция вирусов: иммунологические и патогенетические аспекты. Клин мед 1998; 12: 19—25.

10.Онищенко Г.Г. Заболеваемость клещевым энцефалитом в Российской Федерации. Расширенный пленум Проблемной комиссии «Клещевой энцефалит и другие вирусные энцефалиты» РАМН (9—10.12.03): Материалы. М 2003; 5—6.

11.Пирогова Н.П., Новицкий В.В. и др. Особенности фагоцитарной активности лейкоцитов периферической крови у больных клещевым энцефалитом. Бюл экспер биол 2002; 1: 82—85.

12.Пирогова Н.П., Новицкий В.В. Фагоцитарные функции крови у больных острым клещевым энцефалитом. Бюл экспер биол 2003;

1:83—85.

13.Ратникова Л.И. Современные представления о патогенезе клещевого энцефалита. Журн микробиол эпидемиол и иммунобиол 2002; 5: 41—46.

14.Рязанцева Н.В. Структурные и функциональные особенности лимфоцитов при хроническом течении клещевого энцефалита. Бюл экспер биол 2002; 11: 547—550.

15.Фрейдлин И.С. Паракринные и аутокринные механизмы цитокиновой иммунорегуляции. Иммунология 2001; 5: 4—7.

16.Шаповал А.И. Клещевой энцефаломиелит. М: Медицина 1980.

17.Ярилин А.А. Система цитокинов и принципы ее функционирования в норме и при патологии. Иммунология 1997; 5: 7—13.

18.de Villiers W.J., Fraser I.P. Cytokine and growth factor regulation of macrophage scavenger receptor expression and function. Immunol Lett 1994; 43: 1—2: 73—79.

19.Hayasaka D., Ivanov L. Distribution and characterization of tickborne encephalitis viruses from Siberia and far-eastern Asia. J Gen Virol 2001; 82: 6: 1319—1328.

20.Samuel Sh.E. Antiviral actions of IFN. Clin Microbiol Rev 2001; 14:

4:778—809.

Поступила 15.11.05