Журнал неврологии и психиатрии / 2010 / NEV_2010_05_013

сивным типом наследования встречаются значительно реже и выделяются в отдельную группу — НМСН 4-го типа [8, 9, 17].

К настоящему времени описано 10 генетических вариантов НМСН 4-го типа, из которых идентифицированы гены [8, 9]. В 1996 г. был картирован локус НМСН 4А на хромосоме 8q13-q21.1 [11], однако ген GDAP1 идентифицирован лишь в 2002 г. Е. Nelis и соавт. [13]. Продукт гена — ганглиозид-индуцированный, ассоциированный с дифференцировкой протеина 1-го типа содержит 358 аминокислот и экспрессируется главным образом в структурах центральной и периферической нервной системы. Белок локализован на наружной мембране митохондрий и обеспечивает процесс фрагментации разветвленной митохондриальной сети периферических нервов. Высказывается также предположение, что он может участвовать в процессе сигнальной трансдукции при формировании нейрона в эмбриональном периоде [12, 14—16]. При исследовании молекулярно-генетических причин аутосом- но-рецессивных форм НМСН у больных из Чехии [1] и Польши [10], обнаружено, что наиболее частой причиной НМСН 4А является мутация Leu239Phe. Исходя из генетической общности славянских народов, можно сделать предположение, что и у российских больных эта мутация должна быть основной причиной НМСН 4А.

Длительное время НМСН 4А типа описывалась в группе демиелинизирующих полинейропатий, и показанием для исследования мутаций в гене GDAP1 служило наличие у больных низких скоростей проведения импульса по срединному нерву. Однако исследованиями последних лет показано, что у большинства обследованных больных, имеющих мутацию в этом гене, СПИ по срединному нерву больше соответствуют аксональному варианту НМСН или являются промежуточными [3, 5, 7, 10]. Противоречивые результаты клинико-электромиографичес- кого обследования больных обусловливают необходимость продолжения исследований, направленных на уточнение диагностических критериев НМСН 4А типа, являющихся основанием для идентификации этого варианта с помощью молекулярно-генетических методов.

Целью исследования явилась разработка критериев диагностики НМСН 4А типа на основании клиникогенетического обследования больных.

Материал и методы

Обследовали 12 больных в возрасте от 5 до 34 лет из 9 неродственных российских семей; длительность болезни у них колебалась от 3 до 29 лет (начало в возрасте от 1 года до 5 лет). Диагноз НМСН 4А у которых был верифицирован на основании молекулярно-генетического обследования. Поиск мутаций в гене GDAP1 осуществляли методом прямого автоматического секвенирования по Сенгеру как с прямого, так и обратного праймеров, на приборе ABI Prism 3100 (Applied Biosystems) с использованием протокола фирмы производителя. В качестве матрицы для секвенирования использовали фрагменты ДНК, полученные после проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием оригинальных олигонуклеотидных праймеров, которые синтезировались в Научно-производст- венном объединении SYNTOL. Анализ результатов секвенирования осуществлялся с помощью программ Chromas и BLAST. В результате молекулярно-генетического иссле-

дования выявлены мутации гена GDAP1 в гомозиготном (одна и та же мутация обнаружена на обеих хромосомах), компаунд-гетерозиготном (на двух гомологичных хромосомах обнаружены разные мутации) или гетерозиготном (обнаружена мутация лишь на одной из пары гомологичных хромосом) состоянии.

Результаты и обсуждение

Как указывалось выше, диагностика НМСН 4А типа осуществлялась на основании ДНК анализа, направленного на поиск мутаций в гене GDAP1. У обследованных больных обнаружены четыре мутации в различных сочетаниях: две миссенс-мутации (приводящие к замене аминокислоты в последовательности белка): Pro153Leu (c.458C>T) и Leu239Phe (c.715C>T); одна нонсенсмутация с образованием преждевременного стоп-кодона, приводящего к преждевременному укорочению полипептидной цепи — Arg257Stop (c.769C>T); одна мутация сайта сплайсинга с.310+3 a>g, также приводящая к преждевременному возникновению стоп-кодона и синтезу укороченной белковой цепи.

В шести семьях у больных мутации обнаружены в гомозиготном или компаунд-гетерозиготном состоянии. В трех семьях у больных выявлена лишь одна мутация в гетерозиготном состоянии, вторую идентифицировать не удалось, что может быть связано с наличием протяженной делеции (выпадением нуклеотидной последовательности целого экзона или даже нескольких экзонов) на одной из хромосом, которую невозможно детектировать методом прямого автоматического секвенирования. Важно отметить, что в восьми из девяти семей с НМСН 4А типа выявлена одна и та же миссенс-мутация Leu239Phe (с.715С>T), приводящая к замене лейцина в 239-м положении белка на фенилаланин, в гомозиготном, компаундгетерозиготном или гетерозиготном состоянии.

Таким образом, было установлено, что описанная мутация гена GDAP1 и у российских больных является основной причиной возникновения НМСН 4А типа. С исследования мутации Leu239Phe (с.715С>T) следует начинать ДНК-диагностику при подозрении на наличие аутосомно-рецессивного варианта наследственных аксональных полинейропатий.

Клинические и электромиографические данные наблюдаемых нами больных с НМСН 4А, обобщены в таблице. Из нее видно, что возраст пациентов к периоду появления первых симптомов заболевания варьировал от 1 года до 5 лет. Первыми признаками заболевания, на которые обращали внимание родители больных, была деформация стоп (по типу полых), а также слабость перонеальных групп мышц, приводящая к появлению степпажной походки. В течение нескольких лет патологический процесс распространялся в восходящем направлении с вовлечением сгибательных и разгибательных групп мышц голеней, межкостных мышц кистей и мышц тенара и гипотенара. У ряда больных с длительностью заболевания более 5 лет атрофии распространялись и на мышцы бедер и тазового пояса. Нарастание вялого тетрапареза приводило к выраженной эквиноварусной деформации стоп, а спустя 2 года — 5 лет от момента манифестации заболевания — к деформации кистей по типу «когтистой лапы». Характерной особенностью НМСН 4А типа было раннее выпадение сухожильных рефлексов с нижних и верхних

ГЕНЕТИКА ПОЛИНЕЙРОПАТИИ

конечностей, а также выраженные расстройства глубокой

иповерхностной чувствительности, что свидетельствовало о значительном поражении крупных миелинизированных нервных волокон. У всех больных были выявлены симптомы сенситивно-мозжечковой атаксии. У 67% обследованных больных наблюдался тремор пальцев вытянутых рук. Среди больных редко отмечались фасцикулярные подергивания различных мышечных групп, которые нередко наблюдаются при других генетических вариантах наследственных аксонопатий. У одной больной наблюдался характерный для НИСН 4А симптом [16] — прогрессирующий парез голосовых связок и связанное с этим огрубление голоса.

На электромиограмме (ЭМГ) у всех больных были отмечены характерные признаки аксонопатии. СПИ по моторным волокнам срединного нерва у большинства больных не превышала контрольных значений. Лишь у больных одной семьи выявлено снижение этого показателя до 32 м/с, что свидетельствовало о наличии смешанного аксонально-демиелинизирующего характера поражения периферических нервов.

Особенности клинических проявлений НМСН 4А типа приведены ниже на примере истории болезни одной из наших пациенток.

Больная 26 лет, единственный ребенок в семье. Родилась в срок от молодых здоровых родителей, не состоящих в кровном родстве. Раннее моторное и психоречевое развитие протекало без патологии. Первые признаки заболевания в виде слабости стоп и появления степпажной походки родители заметили в возрасте 2 лет. Слабость и гипотрофия перонеальных мышц голеней быстро нарастали

ираспространялись на разгибательные группы мышц. Ребенок утратил возможность ходьбы на пятках и носках, появилась эквиноварусная деформация стоп. К 6 годам в патологический процесс оказались вовлечены мышцы бедер и тазового пояса, в которых появилась гипотония, гипотрофия, что привело к использованию миопатических приемов при подъеме из положения на корточках. В возрасте 7 лет (спустя 5 лет от периода манифестации заболевания) патологический процесс распространился на мышцы кистей — появились слабость и гипотрофия межкостных мышц и тенара, и гипотенара.

При осмотре больной в возрасте 26 лет выявлены выраженные атрофии всех мышц голеней, нижней трети бедер, кистей и нижней трети предплечий. Мышечная сила в стопах и кистях составляла 2 балла, в голенях и бедрах

— 3 балла. При подъеме из положения на корточках больная использовала приемы, характерные для пациентов с миопатией. Отмечалась эквиноварусная деформация стоп с формированием контрактур в голеностопных суставах и деформации кистей по типу когтистой лапы. Сухожильные рефлексы с мышц ног и рук вызвать не удалось. Выявлены необычные диссоциированные расстройства чувствительности в зоне пораженных мышц ног — гиперестезия по полиневритическому типу в левой ноге и поверхностная и глубокая гипостезия в правой ноге. В обеих руках выявлена поверхностная и глубокая гипостезия в кистях. Больная не могла стоять в позе Ромберга, отмечался интенционный тремор при выполнении пальцемолоточковой пробы. При перкуссии молоточком провоцировались фасцикуляции в мышцах бедер. Не было отмечено нарушения черепно-мозговой иннервации и вовлечения в процесс лицевой мускулатуры. Интеллект больной был

высоким. Больная передвигалась самостоятельно, сохраняла способность к самообслуживанию и даже управляла машиной.

При проведении игольчатой электромиографии были получены следующие данные: m. abductor digiti minimi sin.: средняя длительность измененных по форме потенциалов двигательных единиц (ПДЕ) увеличена на 70% (15,5 мс при норме 9,1 мс). Средняя и максимальная величины амплитуды ПДЕ во много раз превышают норму и составляют 4127 мкВ при норме до 600 мкВ и 14 136 мкВ при норме до 1200 мкВ. Полифазных ПДЕ нет, псевдополифазных — 15% при норме 5%. m. tibialis ant. dex.: ПДЕ не регистрируются. В покое выявлена спонтанная активность: 4 потенцала фибрилляции (ПФ), 5 положительных острых волн (ПОВ); m. vastus lat. dex.: средняя длительность ПДЕ увеличена на 74% (17,4 мс при норме 10 мс). Средняя и максимальная величины амплитуды ПДЕ превышают норму (1807 мкВ при норме до 500 мкВ и 3940 мкВ — до 1000 мкВ). Полифазных ПДЕ 40% при норме до 5%. В покое выявлена бурная спонтанная активность: ПФ, ПОВ, 3 потенциала фасцикуляций. При проведении стимуляционной ЭМГ получены следующие значения СПИ по n. medianus dex.: 44,0 м/c, М-ответ с m. peroneus dxt. и m. tibialis post. dxt не регистрируется. Заключение: полученные данные не противоречат ЭМГ-картине, наблюдаемой при невральной амиотрофии. ЭМГ данных за заинтересованность мотонейронов спинного мозга не получено. В дистальной мышце ноги ДЕ выявить не удается, в дистальной мышце кисти выявлены признаки резко выраженного реиннервационного процесса с денервацией и признаками декомпенсации. В проксимальной мышце обнаружены наиболее значимые изменения: признаки резко выраженной денервации с распадом большого количества мышечных волокон и нарушением ДЕ.

По результатам ДНК-анализа установлено, что причиной заболевания являются мутации Arg257Stop

ЛИТЕРАТУРА

1.Barankova L., Vyhnalkova E., Zuchner S. et al. GDAP1 mutations in Czech families with early-onset CMT. Neuromuscular Dis 2007; 17: 482—489.

2.Bienfait H., Baas F., Koelman J. et al. Phenotype of Charcot-Marie-Tooth disease Type 2. Neurology 2007; 68: 1658—1667.

3.Birouk N., Azzedine H., Dubourg O. et al. Phenotypical features of a Moroccan family with autosomal recessive Charcot-Marie-Tooth disease associated with the S194X mutation in the GDAP1 gene. Arch Neurol 2003; 60: 4: 598—604.

4.Claramunt R., Pedrola L., Sevilla T. et al. Genetics of Charcot-Marie-Tooth disease type 4A: mutations, inheritance, phenotypic variability, and founder effect. J Med Genet 2005; 42: 4: 358—365.

5.Cuesta A., Pedrola L., Sevilla T. et al. The gene encoding ganglioside-in- duced differentiation-associated protein 1 is mutated in axonal Charcot- Marie-Tooth type 4A disease. Nat Genet 2002; 30: 1: 22—25.

6.De Jonghe P. et al. Charcot-Marie-Tooth disease and related peripheral neuropathies. J Peripher Nerv Syst 1997; 2: 4: 370—387.

7.De Sandre-Giovannoli A., Chaouch M., Boccaccio I. et al. Phenotypic and genetic exploration of severe demyelinating and secondary axonal neuropathies resulting from GDAP1 nonsense and splicing mutations. J Med Genet 2003; 40: 7: e87.

8.http://www.molgen.ua.ac.be/CMTMutations/DataSource/MutByGene. cfm. CMT mutation data base.

9.http://www.neuro.wustl.edu/neuromuscular/time/hmsn.html. Neuromuscular Disease Center.

10.Kabzinska D., Drac H., Rowinska-Marcinska K. et al. Early onset Charcot- Marie-Tooth disease caused by a homozygous Leu239Phe mutation in the GDAP1 gene. Acta Myol 2006; 25: 1: 34—37.

(c.769C>T) и Leu239Phe (c.715C>T) гена GDAP1 в компаунд-гетерозиготном состоянии.

На основании результатов собственных исследований и анализа данных литературы можно сформулировать критерии отбора больных для проведения ДНК-диагностики с целью поиска мутации в гене GDAP1: 1) аутосомнорецессивный тип наследования НМСН; 2) манифестация заболевания до 5 лет; 3) генерализация мышечного поражения с постепенным вовлечением в патологический процесс всех групп мышц голеней, стоп, кистей, а по мере прогрессирования заболевания и мышц бедер; 4) раннее угасание всех сухожильных рефлексов; 5) выраженные расстройства всех видов чувствительности; 6) быстрое формирование грубых деформаций стоп, чаще по типу эквиноварусных, и рук по типу «когтистой лапы».

В обследованной нами выборке у всех больных на основании данных ЭМГ был диагностирован аксональный вариант НМСН. В связи с этим напомним, что впервые НМСН 4А типа была описана в семье с сегрегацией демиелинизирующего варианта наследственных полинейропатий. Таким образом, при направлении больных на генетическое исследование основное внимание должно быть обращено на наличие клинико-генеалогических критериев отбора, при этом показатели СПИ по срединному нерву могут варьировать от 25 м/с до контрольных значений. Учитывая, что НМСН 4А типа является самым частым генетическим вариантом наследственных полинейропатий с аутосомно-рецессивным типом наследования, ДНК-анализ, направленный на поиск мутации в гене GDAP1, должен проводиться всем больным как с аксональным, так и демиелинизирующим вариантом НМСН с ранним началом и тяжелым течением.

При проведении ДНК анализа у больных славянского происхождения в первую очередь должна быть исследована мажорная мутация в гене GDAP1 — Leu239Phe (c.715C>T).

11.Kalaydjieva L., Hallmayer J., Chandler D. et al. Gene mapping in Gypsies identifies a novel demyelinating neuropathy on chromosome 8q24. Nat Genet 1996; 14: 2: 214—217.

12.Marco A., Cuesta A., Pedrola L. et al. Evolutionary and structural analyses of GDAP1, involved in Charcot-Marie-Tooth disease, characterize a novel class of glutathione transferase-related genes. Mol Biol Evol 2004; 21: 1: 176—187.

13.Nelis E., Erdem S., Van Den Bergh P.Y. et al. Mutations in GDAP1: autosomal recessive CMT with demyelination and axonopathy. Neurology 2002; 59: 12: 1865—1872.

14.Niemann A., Ruegg M., La Padula V. et al. Ganglioside-induced differentiation associated protein 1 is a regulator of the mitochondrial network: new implications for Charcot-Marie-Tooth disease. J Cell Biol 2005; 170: 7: 1067—1078.

15.Pedrola L., Espert A., Wu X. et al. GDAP1, the protein causing Charcot- Marie-Tooth disease type 4A, is expressed in neurons and is associated with mitochondria. Hum Mol Genet 2005; 14: 8: 1087—1094.

16.Stojkovic T., Latour P., Viet G. et al. Vocal cord and diaphragm paralysis, as clinical features of a French family with autosomal recessive Charcot-Ma- rie-Tooth disease, associated with a new mutation in the GDAP1 gene. Neuromuscul Dis 2004; 14: 4: 261—264.

17.Vallat J.M., Grid D., Magdelaine C. et al. Autosomal recessive forms of Charcot-Marie-Tooth disease. Curr Neurol Neurosci Rep 2004; 4: 5: 413— 419.