Журнал неврологии и психиатрии / 2005 / NEV_2005_03_08

Боковой амиотрофический склероз (БАС) — хроническое прогрессирующее заболевание нервной системы, обусловленное преимущественным поражением двигательных нейронов спинного мозга, ствола мозга и коры головного мозга. Заболевание в подавляющем большинстве случаев регистрируется как спорадическое. Оно отличается хроническим, неуклонно прогрессирующим течением и неблагоприятным прогнозом. Смерть пациентов обычно наступает вследствие сердечно-легочной недостаточности. Продолжительность БАС при разных его формах различ- на, составляя от 3 до 12 лет. Этиология заболевания неясна, и согласно современным представлениям, оно обусловлено взаимодействием наследственных и экзогенных провоцирующих факторов [1, 2, 4].

БАС в целом характеризует широкий спектр нарушений биологических процессов [10, 13, 16], что позволяет рассматривать его как системное. В связи с этим изучаются не только нервная, но и другие, в том числе периферические, ткани и форменные элементы крови. Так, в тромбоцитах крови были обнаружены изменения функций митохондрий [17], кроме того, в тромбоцитах выявлено нарушение функции транспорта глутамата со снижением скорости захвата 3H-глутамата по сравнению со здоровыми людьми и

© Коллектив авторов, 2005

больными, страдающими хроническими неврологи- ческими заболеваниями [10]. В межклеточном матриксе и базальной мембране скелетных мышц, сыворотке крови больных БАС заметно возрастает уровень тромбоспондина — гликопротеина, освобождаемого из α-гранул тромбоцитов при их активации [13, 15]. Все это позволяет предположить, что в крови больных присутствуют факторы, вызывающие активацию тромбоцитов.

Цель настоящего исследования — сравнительное изучение состояния поверхностной структуры тромбоцитов периферической крови у больных БАС и больных рассеянным склерозом (РС).

Материал и методы

Обследовали 32 больных БАС и 6 больных РС. Все они находились на лечении в стационаре отделения нейроинфекций НИИ неврологии РАМН (руководитель — проф. И.А. Завалишин).

Диагноз БАС был поставлен согласно классификации О.А. Хондкариана и соавт. [5] с выделением: шейно-грудной, пояснично-крестцовой, бульбарной и генерализованной форм. При оценке клинической картины РС использовалась шкала J. Kurtzke [11].

Кровь брали из локтевой вены утром натощак в пластмассовые флаконы, содержащие цитратный антикоагулянт.

Суспензию тромбоцитов получали гель-фильтрацией с использованием сефарозы CL-2B, что позволяет иметь дело с клетками, очищенными от белковых и других элементов плазмы [18].

Изучение поверхностной структуры тромбоцитов проводили с помощью сканирующего электронного микроскопа Philips 501 Sem (Голландия).Взвесь тромбоцитов фиксировали в 2,5% глутаральдегиде, после промывки буфером осаждали центрифугированием на алюминиевую фольгу и дегидратировали в ряду этанола восходящей концентрации. Подробное описание метода приведено в нашей предыдущей работе [3].

Для выявления признаков активации тромбоцитов [3]

èоценки их выраженности проводили ранжирование параметров их поверхностной структуры. При этом использовали соответствующие градации изменений в баллах.

Выраженность псевдоподий: 0 — их отсутствие, 1 — псевдоподии менее чем у 20% клеток, 2 — не более чем у 30% клеток, 3 — у 30—50% клеток, 4 — более чем у 50% клеток. Степень агрегации: 0 — ее отсутствие, 1 — клетки с псевдоподиями, образующие скопления до 8 клеток, 2 — мелкие конгломераты (8—10 клеток), 3 — конгломераты средней величины (более 10 клеток), 4 — крупные конгломераты, напоминающие виноградные кисти (более выраженные скопления). Степень лизиса: 0 — его отсутствие, 1 — наблюдаются отдельные лизированные клетки, 2 — на фоне сохраняющихся целых клеток имеются небольшие скопления лизированных клеток, 3 — наблюдаются агрегаты лизированных клеток (8—10 клеток), 4 — наблюдаются массивы лизированных клеток.

Для оценки степени активации тромбоцитов использовали для каждого пациента случайный отбор 10 полей зрения при увеличении микроскопа 5000. В каждом поле зрения подсчитывали число клеток с псевдоподиями, оценивали степень выраженности агрегации, лизиса. Затем определяли среднее значение показателя для всех полей зрения. Ввиду невозможности точного подсчета числа клеток в агрегатах для количественной оценки степени активации тромбоцитов применяли ординальную (ранговую) шкалу измерений

èпри анализе результатов использовали непараметрическую статистику.

Сравнение тромбоцитов у больных БАС и больных РС проводили с помощью теста Манна — Уитни. Статистиче- скую обработку данных проводили с помощью пакета про-

грамм Statistica 6.0.

Результаты и обсуждение

Изучение поверхностной структуры тромбоцитов периферической крови больных БАС и РС с помощью сканирующей электронной микроскопии выявило значительную активацию этих клеток. На рис. 1 представлены типичные картины тромбоцитов здоровых лиц и больных БАС и РС. Но изменения морфологической структуры тромбоцитов у больных БАС и больных РС несколько различаются, что более четко проявляется при оценке активации тромбоцитов по количественным показателям — наличию псевдоподий, степени агрегации и лизиса клеток (рис. 2).

По количеству псевдоподий достоверных разли- чий между группами БАС и РС не обнаружено. Агрегация тромбоцитов более выражена у больных БАС, лизис тромбоцитов наблюдали только у больных БАС. Этому соответствуют изменения на рис. 1. Можно видеть, что они наиболее существенны в картине поверхностной структуры тромбоцитов больных БАС, у которых наряду с образованием псевдоподий выявлены агрегаты лизированных клеток. Что касается

à

á

â

Рис.1. Тромбоциты периферической крови здорового (а), больного БАС (б) и больного РС (в). Ув. 5000.

тромбоцитов больных РС, то лизис клеток в них не наблюдался и изменения ограничивались значительным количеством псевдоподий и некоторой агрегацией.

Как уже отмечалось, признаки активации тромбоцитов были при этих двух заболеваниях различны. Установление внешних проявлений БАС и РС и их выраженности может помочь при установлении диагноза даже на начальном этапе болезни. Более тяжелому течению БАС соответствуют и более выраженные изменения поверхностной структуры тромбоцитов, чем для менее тяжелого течения. При продолжении работы представляется необходимым изучение боль-

Рис. 2. Активация тромбоцитов периферической крови больных БАС (светлые столбцы) и больных РС (темные столбцы) по наличию псевдоподий, степени агрегации и лизиса.

Горизонтальными линиями отмечены значения переменной в 1-м и 3-м квартилях. Достоверные различия между группами больных: * — р<0,05; ** — р<0,001.

шего числа больных для установления степени активации тромбоцитов в зависимости от формы, длительности и тяжести заболевания. Есть основания предполагать, что активация тромбоцитов является реакцией на появление в крови какого-то пока не установленного гуморального фактора. Возможно, это соединение, запуская механизм разрушения нервномышечной системы, одновременно поражает тромбоцит. В связи с этим уместно отметить, что тромбоцит и нервная система происходят из одного зародышевого листка; более того, установлена идентичность ряда рецепторов мембран нервных клеток и тромбоцитов [12].

Активация тромбоцитов при БАС согласуется с выявлением в межклеточном матриксе, базальной

мембране скелетных мышц и в сыворотке крови больных увеличенного содержания тромбоспондина, который выделяется из тромбоцитов при их активации [13, 15]. Указанная активация соответствует и уменьшению транспорта глутамата мембранами клеток и изменению функции митохондрий [10, 16, 17].

Полученные данные могут быть рассмотрены также в аспекте механизмов, приводящих к развитию БАС. Особенностью БАС является его позднее нача- ло: в большинстве случаев это возраст 54—61 год [2]. Предполагают, что какие-то системы в организме к этому возрасту «изнашиваются» и именно они могут быть ответственны за запуск болезненного процесса. В связи с этим особый интерес представляют митохондрии, функциональная активность которых при старении снижается [6, 14, 19]. При БАС снижение функциональной активности митохондрий отмече- но во многих клетках — клеточных элементах нервной ткани, печени, мышц, в лимфоцитах, тромбоцитах [7—9, 16, 17, 20]. Однако при БАС поражаются не все мышцы. Так, мышцы кишечника, мочевого пузыря, половых органов, сердца остаются интактными [2]. Особенно тяжелы поражения скелетных мышц, имеющих большие размеры и иннервируемых нервными клетками, волокна которых отли- чаются значительной протяженностью и работа которых требует больших затрат энергии. Можно предположить, что при достижении больными зрелого возраста выявляется недостаточность обеспечиваемой скелетными мышцами дыхательной системы, которая запускает механизм обратной связи: недостаточное потребление кислорода усугубляет снижение функциональной активности митохондрий вплоть до летального исхода. В этом аспекте представляется важным изучение особенностей структуры и функций митохондрий у больных БАС и РС разного возраста.

ЛИТЕРАТУРА

1.Завалишин И.А. Боковой амиотрофический склероз. В кн.: Малая медицинская энциклопедия. М 1991; 1: 88—89.

2.Завалишин И.А., Захарова М.Н. Боковой амиотрофический склероз. Неврол журн 1998; 3: 4: 4—7.

3.Киктенко А.И., Злобина Г.П., Щурин М.Р. и др. Влияние разных способов выделения тромбоцитов на поверхностную структуру

èбиохимические параметры серотониновой системы этих клеток. Бюл экспер биол мед 1991; 62: 11: 485—488.

4.Скворцова В.И., Лимборская С.А., Сломинский П.А. и др. Журн неврол психиат 2003; 103: 11: 46—52.

5.Хондкариан О.А., Бунина Т.Л., Завалишин И.А. Боковой амиотрофический склероз. М 1978; 28—38.

6.Beal M.F. Aging, energy, and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Ann Neurol 1995; 38: 3: 357—366.

7.Beal M.F. Mitochondria and the pathogenesis of ALS. Brain 2000;

123:7: 1291—1292.

8.Cluskey S., Ramsden D.B. Mechanisms of neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis. J Clin Pathol Mol Pathol 2001; 54: 386—392.

9.Curti D., Malaspina A., Facchetti G. et al. Amyotrophic lateral sclerosis: oxidative energy metabolism and calcium homeostasis in peripheral blood lymphocytes.Neurology 1996; 47: 4: 1060—1064.

10.Ferrarese C., Sala G., Riva R. et al. Decreased platelet glutamate uptake in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Neurology 2001;

56:2: 270—272.

11.Kurtzke J.F. Rating neurologic impairment in multiple sclerosis: an expanded disability status scale (EDSS). Neurology 1983; 33: 11: 1444—1452.

12.Pletscher A. Platelets as models: use and limitations. Experientia 1988;

44:2: 152—155.

13.Rao J.S., Hantai D., Festoff B.W. Thrombospondin, a platelet alphagranule and matrix glycoprotein, is increased in muscle basement membrane of patients with amyotrophic lateral sclerosis. J Neurol Sci 1992; 113: 1: 99—107.

14.Singh K.K. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in aging and cancer. Ann N Y Acad Sci 2004; 1019: 260—264.

15.Smirnova I.V., Festoff B.W. Alterations in serum thrombospondin in patients with amyotrophic lateral sclerosis. J Neurol Sci 1994; 127:

2:207—213.

16.Strong M.J. Progress in clinical neurosciences: the evidence for ALS as a multisystems disorder of limited phenotypic expression. Can J Neurol Sci 2001; 28: 4: 283—298.

17.Swerdlow R.H., Parks J.K., Cassarino D.S. et al. Mitochondria in sporadic amyotrophic lateral sclerosis. Exp Neurol 1998; 153: 1: 135— 142.

18.Tangen O., Berman H.J., Marfey P. Gel filtration. A new technique for separation of blood platelets from plasma. Thromb Diath Haemorrh 1971; 25: 2: 268—278.

19.Toescu E.C., Xiong J. Metabolic substrates of neuronal aging. Ann N Y Acad Sci 2004; 1019: 19—23.

20.Vielhaber S., Kunz D., Winkler K. et al. Mitochondrial DNA abnormalities in skeletal muscle of patients with sporadic amyotrophic lateral sclerosis. Brain 2000; 123: 7: 1339—1348.

Поступила 05.10.04