Добавил:
proza.ru http://www.proza.ru/avtor/lanaserova Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
Скачиваний:
16
Добавлен:
15.09.2017
Размер:
244.7 Кб
Скачать

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ

Влияние L-ДОФА на мозг в зависимости от индивидуальных особенностей поведения

А.В. СЕРГУТИНА, Л.М. ГЕРШТЕЙН

Influence of L-DOPA on rat brain depending on individual behavioral features

A.V. SERGUTINA, L.M. GERSHTEIN

Лаборатория ультраструктуры и цитохимии мозга Института мозга РАМН, Москва

Крысам генетических линий Август и Вистар, различающимся по исходной реактивности на стресс и двигательной активности в «открытом поле», в течение 14 дней вводили L-ДОФА, создавая условия гиперактивности дофаминергической системы мозга. L-ДОФА применяли в форме препарата мадопар в дозе 25,5 мг/кг массы тела ежедневно, изучали показатели активности ферментов обмена нейромедиаторов и белков: аминопептидазы (АМП), глутаматдегидрогеназы (ГДГ), МАО (субстрат триптамин), АХЭ в сенсомоторной коре, хвостатом и прилежащем ядрах и гиппокампе (область СА3). Установили внутрилинейные и межлинейные особенности влияния L-ДОФА на мозг крыс. Наиболее четко они проявляются у животных с низкой двигательной активностью. При этом у особей с низкой двигательной активностью изменения отмечаются во всех структурах и со стороны всех ферментов, а в группе с высокой двигательной активностью они касались только ГДГ в хвостатом и прилежащем ядрах. По комплексу цитохимических показателей основной структурой, реагирующей на L-ДОФА, является гиппокамп. При этом его реакции у крыс линии Август обеспечиваются в основном серотонинергической системой, а у животных линии Вистар — ацетилхолинергической и глютаматергической. Считают, что при индивидуальном прогнозировании устойчивости к стрессу и экстремальным ситуациям важное место следует отводить исходной генетически обусловленной эмоциональной реактивности и двигательной активности.

Ключевые слова: мозг крыс, генетика поведения, L-ДОФА, мадопар, обмен нейромедиаторов и белков.

To cause brain dopaminergic hyperactivity in rats, L-DOPA was injected in August and Wistar rats with different basic stress reactivity and motor activity in open field ecperiments during 14 days. L-DOPA was used in the form of the drug madopar in dosage of 25,5 mg/kg of body mass daily. The indices of activity of metabolism enzymes, neuromediators and proteins: aminopeptidase, glutamatedehydrogenase, monoaminoxidase (substrate triptamine) and acetylcholinesterase were studied in sensomotor cortex, caudate nucleus, nucleus accumbens and hippocampus region. The intraand between-line features of L-DOPA influence on rat brain have been found, being mostly pronounced in the animals with low motor activity. In these rats, changes were observed in all structures and for all enzymes, but in the group with high activity they concerned only GDH in caudate nucleus and nucleus accumbens. Hippocampus was the structure reacting to L-DOPA most actively as shoun by cytochemical indices, with reactions relating mainly to serotonergic system in August rats and to acetylcholinergic and glutamatergic systems in Wistar rats. The results demonstrate an essential role of genetically determined reactivity and motor activity in individual prognosis of resistance to stress and extreme situations.

Key words: rat brain, behavioral genetics, L-DOPA, madopar, neuromediator and protein metabolism.

Zh Nevrol Psikhiatr Im SS Korsakova 2004;104: 12: 56—59

Известно, что сильное стрессовое воздействие может явиться причиной психических и психосоматических нарушений. В таких случаях патогенез расстройств определяется не только гуморальными механизмами по Г. Селье [12], но и реакцией центральной и вегетативной нервной систем [17, 18]. При индивидуальном прогнозировании устойчивости или предрасположенности субъектов к стрессовым реакциям особое значение имеют тип поведения и особенности личности.

© А.В. Сергутина, Л.М. Герштейн, 2004

Рядом авторов [10, 15, 16, 20, 21] было высказано предположение, что у животных можно выявить не только типы высшей нервной деятельности, но и психологические типы, сходные с таковыми у человека. На принципиальную возможность использования поведенческих реакций животных в качестве моделей психических функций, лежащих в основе поведения человека, указывают и работы по генетике поведения [5]. В этом отношении особый интерес представляют крысы разных генетических линий, в частности Вистар и Август. Крысы линии Вистар известны своей устойчивостью к стрессу, в то время как крысы линии Август предрасположены к нему. Это

56

ЖУРНАЛ НЕВРОЛОГИИ И ПСИХИАТРИИ, 12, 2004

ГЕНЕТИКА ПОВЕДЕНИЯ

дало основание рассматривать эти линии как генети- ческие модели разных реакций на стрессовую ситуацию. В норме эти животные отличаются межлинейно и внутрилинейно по цитохимическим показателям обмена нейромедиаторов и белков в зависимости от высокой или низкой двигательной активности в «открытом поле» [2, 4, 13], а в условиях реакции на острый стресс также по содержанию дофамина, норадреналина и адреналина в надпочечниках [18].

Ранее нами [3, 7] было установлено, что крысы линии Вистар с высокой и низкой двигательной активностью в «открытом поле» после введения L-ДОФА, т.е. при создании гиперактивности дофаминергиче- ской системы, могут служить моделью двигательных расстройств у человека. Существенно, что при этом возникают определенные морфохимические сдвиги в двигательных структурах мозга. Однако реакции на стресс разных линий животных не исследовались.

Целью настоящей работы было изучение обмена нейромедиаторов и белков в мозге крыс линий Август и Вистар, т.е. предрасположенных и устойчивых к стрессу, в условиях гиперактивности дофаминерги- ческой системы в зависимости от исходного двигательного и эмоционального поведения животных.

Материал и методы

В исследовании были использованы 12 крыс-сам- цов линии Вистар массой тела 200—220 г и 6 крыссамцов линии Август массой тела 180—200 г. Для определения двигательной активности животных тестировали в «открытом поле». Если по горизонтальной плоскости крысы линии Вистар пересекали менее 70 квадратов, то они определялись как животные с низкой двигательной активностью (НДА В), если пересекали более 140 квадратов — с высокой двигательной активностью (ВДА В). У предрасположенных к стрессу крыс линии Август исследовали только одну группу — с низкой двигательной активностью (НДА А).

После тестирования каждая группа крыс была разделена на 2 подгруппы — контрольную и опытную. Животным контрольной подгруппы вводили внутрибрюшинно физиологический раствор, а животным опытной подгруппы в течение 2 нед внутрибрюшинно вводили L-ДОФА в форме препарата мадопар-125 в дозе 25,5 мг/кг массы тела ежесуточно1. Мадопар-125 состоит из 100 мг леводопы и 25 мг ингибитора периферической декарбоксилазы — бенсеразида гидрохлорида, препятствующего его расщеплению, он используется в клинике для лечения паркинсонизма).

Методами количественной цитохимии определяли активность ферментов обмена белков и нейромедиаторов в следующих структурах мозга: в сенсомоторной коре (слои III и V), в хвостатом ядре, а также в прилежащем ядре (мезолимбическая система) и поле СА3 гиппокампа (лимбическая система). Последние две структуры, как известно, не имеют непосредственного отношения к двигательной функции.

1 Использовали препарат фирмы “Hoffman La Roche” (Швейцария).

Через 30—40 мин после последней инъекции ма- допара-125 не менее 3 крыс каждой из указанных выше подгрупп декапитировали под легким эфирным наркозом. Активность ферментов определяли в криостатных срезах толщиной 20 мкм, изготовленных из блоков мозга, замороженных в микротоме Крио-кат (США).

Для изучения были выбраны следующие ферменты: аминопептидаза (АМП), глутаматдегидрогеназа (ГДГ), моноаминоксидаза (МАО) и ацетилхолинэстераза (АХЭ). При этом мы учитывали, что АМП является ферментом пластического обмена и участвует в распаде белков организма. ГДГ — фермент обмена глютаминовой кислоты, связывает метаболизм аминокислот с циклом Кребса, в том числе через γ-аминобутиратный шунт, ее анион глутамат является нейромедиатором ЦНС, особенно важным для такой структуры, как гиппокамп [9]. АХЭ участвует в инактивировании ацетилхолина в холинергической системе, в которую также входит гиппокамп [19]. Активность МАО на субстрате триптамин исследуется как один из показателей изменения состояния серотониновых рецепторов [6, 23].

Активность АМП выявляли по методу Л.М. Герштейн [1], ГДГ — по L. Rubinstein и соавт. [25], MAO (субстрат триптамин) — по G. Glenner и соавт. [22], АХЭ — по M. Karnovsky и J. Roots [24]. Продукты гистохимических реакций цитофотометрировали с помощью микроскопа ЛЮМАМ-И 3 (Россия) с максимумом поглощения при длине волны для ГДГ и МАО 589 нм, для АХЭ — 488 нм, для АМП — 550 нм. Используя зонд диаметром 2,5 мкм, измеряли по 150 нейронов или проводили 150 дискретных измерений нейропиля (МАО и АХЭ). Подробное описание использованных методик имеется в ранее опубликованной работе [14].

Оценку статистической значимости полученных данных проводили по t-критерию Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Активность исследованных ферментов в группах крыс Вистар — ВДА В и НДА В — после введения мадопара по сравнению с контрольными группами представлена в табл. 1.

В группе ВДА В после введения мадопара в хвостатом и прилежащем ядрах мозга выявлен более высокий (±23 и ±12% соответственно) уровень активности ГДГ, а показатели активности АМП, МАО и АХЭ у контрольных и подопытных животных практи- чески не отличались. В слоях III и V сенсомоторной коры и гиппокампе отличий исследованных показателей от контрольного уровня не обнаружено.

У крыс группы НДА В в отличие от контрольных крыс и крыс ВДА В после введения мадопара в слоях III и V сенсомоторной коры уровень активности АМП был ниже на 17—18%, в то время как в хвостатом ядре подопытных животных показатели активности АМП и ГДГ были снижены соответственно на 22 и 13%, в прилежащем ядре — снижены соответственно на 13 и 18%, а в их гиппокампе на 21% была повышена активность ГДГ и на 13% увеличен показатель активности АХЭ.

ЖУРНАЛ НЕВРОЛОГИИ И ПСИХИАТРИИ, 12, 2004

57

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ

Таблица 1. Влияние L-ДОФА (мадопара) на активность ферментов в мозге крыс линии Вистар, M±m

 

ÀÌÏ

 

ÃÄÃ

ÌÀÎ

 

ÀÕÝ

Структуры мозга

 

 

 

 

 

 

 

 

Kонтроль

L-ÄÎÔÀ

Kонтроль

L-ÄÎÔÀ

Kонтроль

L-ÄÎÔÀ

Kонтроль

L-ÄÎÔÀ

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Группа ВДА В

 

 

 

 

Ñëîé III êîðû

0,398±0,002

0,425±0,003

0,561±0,002

0,614±0,004

0,396±0,003

0,384±0,003

0,378±0,003

0,382±0,002

 

 

(106,8)

 

(109,4)

 

(97,0)

 

(102,7)

Ñëîé V êîðû

0,560±0,004

0,592±0,003

0,764±0,004

0,812±0,006

0,497±0,002

0,491±0,002

0,576±0,004

0,558±0,004

 

 

(105,7)

 

(106,3)

 

(98,8)

 

(96,9)

Хвостатое ядро

0,537±0,003

0,537±0,003

0,762±0,007

0,934±0,006*

0,303±0,003

0,305±0,002

1,876±0,016

1,784±0,009

 

 

(100,0)

 

(122,6)

 

(100,6)

 

(95,1)

Прилежащее

0,613±0,003

0,571±0,004

0,839±0,006

0,942±0,008*

0,358±0,003

0,361±0,003

1,508±0,009

1,566±0,008

ÿäðî

 

(93,1)

 

(112,3)

 

(100,8)

 

(103,4)

Гиппокамп

0,502±0,004

0,972±0,006

0,595±0,005

0,574±0,004

0,372±0,003

0,398±0,003

0,797±0,006

0,803±0,006

 

 

(92,9)

 

(96,5)

 

(107,0)

 

(100,1)

 

 

 

 

Группа НДА В

 

 

 

 

Ñëîé III êîðû

0,533±0,004

0,443±0,004*

0,888±0,007

0,920±0,008

0,560±0,004

0,579±0,004

0,637±0,005

0,658±0,006

 

 

(83,1)

 

(103,6)

 

(103,4)

 

(103,3)

Ñëîé V êîðû

0,709±0,006

0,582±0,003*

1,126±0,011

1,129±0,012

0,623±0,004

0,628±0,005

0,907±0,008

0,959±0,009

 

 

(82,0)

 

(100,3)

 

(100,8)

 

(105,7)

Хвостатое ядро

0,606±0,005

0,471±0,004*

1,260±0,011

1,101±0,010*

0,490±0,004

0,453±0,005

1,516±0,012

1,544±0,011

 

 

(77,7)

 

(87,4)

 

(92,4)

 

(101,8)

Прилежащее

0,536±0,005

0,464±0,002*

1,440±0,011

1,193±0,011*

0,511±0,003

0,513±0,004

1,432±0,010

1,417±0,013

ÿäðî

 

(86,6)

 

(82,8)

 

(100,4)

 

(99,0)

Гиппокамп

0,531±0,005

0,550±0,006

0,765±0,008

0,922±0,013

0,509±0,004

0,493±0,005

1,156±0,011

1,309±0,013*

 

 

(103,6)

 

(120,5)

 

(96,9)

 

(113,2)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Примечание. Здесь и в табл. 2: активность ферментов выражена в условных единицах оптической плотности, измеренной при соответствующей длине волны (см. Методы исследования). В скобках приведены изменения активности в процентах по отношению к принятым за 100% значениям у контрольных животных. * — достоверные изменения на уровне p<0,05 по сравнению с контролем.

Таким образом, нами выявлены внутрилинейные

изменения изучавшихся показателей в корково-под-

особенности влияния L-ДОФА на мозг крыс, кото-

корковых структурах мозга крыс в группе НДА А. Вве-

рые в большей степени проявляются у животных с

дение мадопара крысам линии Август вызывало по-

низкой двигательной активностью (группа НДА В).

вышение активности АМП и ГДГ, т.е. ферментов, свя-

Что касается корреляции исходной двигательной ак-

занных с пластическим обменом, а у крыс Вистар —

тивности и реактивности животных с морфохимиче-

к ее снижению дифференцированно в слоях коры,

скими сдвигами в условиях действия L-ДОФА, то

прилежащем и хвостатом ядрах. Под влиянием

полученные данные свидетельствуют о том, что по

L-ДОФА у крыс линии Август активность МАО была

использованным цитохимическим критериям в ней-

увеличена в хвостатом ядре, а у крыс линии Вистар

рохимическом ответе на введение L-ДОФА у особей

она не изменилась. При этом изменений активности

с низкой двигательной активностью изменения от-

АХЭ в коре и подкорковых ядрах у крыс линий Ав-

мечаются во всех структурах и со стороны всех иссле-

густ и Вистар отмечено не было. В гиппокампе, для

дованных ферментов, имеющих отношение к форми-

которого глютаминовая кислота является источником

рованию и реализации целенаправленного поведения,

возбуждающего нейромедиатора глютамата, введение

а в группе с высокой двигательной активностью —

L-ДОФА вызвало у крыс линии Август увеличение

изменения определяются только со стороны ГДГ в

активности МАО, а у крыс Вистар — увеличение ак-

хвостатом и прилежащем ядрах мозга.

тивности АХЭ и ГДГ.

Для крыс линии Август с низкой двигательной

Таким образом, ключевой структурой в реак-

активностью — группа НДА А (табл. 2) — характерно

ции животных на действие L-ДОФА является гип-

увеличение активности АМП на 16% в слое III сен-

покамп — структура лимбической системы. Это под-

сомоторной коры, в то время как в слое V коры все

тверждает известный факт, что в стрессовых ситуа-

исследованные показатели были без достоверных из-

циях, сопровождающихся гиперфункцией дофами-

менений. В хвостатом ядре и гиппокампе подопытных

нергической системы, лимбическая система явля-

животных была выявлена более высокая активность

ется ведущей в перестройке функций ЦНС. По на-

МАО (+11 и +54% соответственно). В прилежащем ядре

шим данным, у крыс линий Август и Вистар ответ-

мозга этой группы животных была увеличена на 14%

ная реакция гиппокампа на действие L-ДОФА обес-

активность АМП и ГДГ.

печивается различными нейрохимическими меха-

При сравнении крыс Август и Вистар — группы

низмами: преимущественно серотонинергической

НДА А и группы ВДА В (см. табл. 1 и 2) — было уста-

системой у крыс линии Август и ацетилхолинерги-

новлено, что мадопар вызывает более выраженные

ческой и глутаматергической системами у крыс

58

ЖУРНАЛ НЕВРОЛОГИИ И ПСИХИАТРИИ, 12, 2004

ГЕНЕТИКА ПОВЕДЕНИЯ

Таблица 2. Влияние L-ДОФА на активность ферментов в мозге крыс линии Август (группа НДА А), M±m

 

ÀÌÏ

 

ÃÄÃ

ÌÀÎ

ÀÕÝ

Структуры мозга

 

 

 

 

 

 

 

 

контроль

L-ÄÎÔÀ

контроль

L-ÄÎÔÀ

контроль

L-ÄÎÔÀ

контроль

L-ÄÎÔÀ

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Ñëîé III êîðû

0,410±0,003

0,475±0,003*

0,559±0,003

0,565±0,004

0,381±0,002

0,373±0,003

0,404±0,003

0,390±0,003

 

 

(115,9)

 

(101,1)

 

(97,9)

 

(96,5)

Ñëîé V êîðû

0,576±0,004

0,624±0,004

0,805±0,005

0,753±0,006

0,500±0,002

0,488±0,003

0,583±0,004

0,555±0,003

 

 

(108,3)

 

(93,5)

 

(97,6)

 

(95,2)

Хвостатое ядро

0,550±0,003

0,569±0,003

0,788±0,005

0,849±0,008

0,290±0,002

0,321±0,003*

1,727±0,010

1,624±0,009

 

 

(103,5)

 

(107,7)

 

(110,7)

 

(94,0)

Прилежащее ядро

0,564±0,004

0,643±0,004*

0,815±0,005

0,927±0,008*

0,380±0,002

0,390±0,002

1,504±0,007

1,520±0,009

 

 

(114,0)

 

(113,7)

 

(102,6)

 

(101,1)

Гиппокамп

0,449±0,002

0,457±0,002

0,546±0,002

0,572±0,003

0,259±0,002

0,400±0,003*

0,784±0,004

0,752±0,005

 

 

(101,8)

 

(104,8)

 

(154,4)

 

(95,9)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

линии Вистар. Это в определенной мере соответствует данным литературы [11] о различиях в поведении крыс указанных линий: у крыс линии Август отмечается заторможенность движений и длительная неподвижность в различных позах на периферии «открытого поля», а у крыс линии Вистар — потеря чувства страха (частый выход в центр, стойки в центре «открытого поля»).

Полученные в настоящей работе результаты дают нам основание отметить, что повышение уровня до-

фамина в организме, в том числе при передозировке препаратов L-ДОФА, у человека может оказывать различное влияние на поведение, обусловленное особенностями нейрохимических перестроек в лимбиче- ской системе мозга и типом нервной системы. Поэтому при индивидуальном прогнозировании устойчи- вости к стрессу и экстремальным ситуациям важное место следует отводить исходной генетически обусловленной эмоциональной реактивности и двигательной активности.

ЛИТЕРАТУРА

1.Герштейн Л.М. К методу гистохимического выявления аминопептидазы в нервной ткани. Цитология 1965; 7: 6: 769—773.

2.Герштейн Л.М., Камышева А.С., Чеботарева Т.Л. и др. Морфохимическая характеристика мозга крыс линии Вистар, различающихся по локомоторной активности в открытом поле. Журн высш нервн деят 1991; 41: 2: 300—306.

3.Герштейн Л.М., Сергутина А.В., Кукуев Л.А. Влияние отмены препаратов L-ДОФА на вызванные ими патохимические изменения двигательных структур мозга. Вопр мед химии 1994; 40: 5: 4—8.

4.Герштейн Л.М., Сергутина А.В., Худоерков Р.М. Морфохимиче- ская характеристика мозга крыс, генетически предрасположенных (Август) и устойчивых (Вистар) к эмоциональному стрессу. Нейрохимия 2000; 17: 2: 135—139.

5. Колпаков В.Г. Кататония у животных. Новосибирск: Наука 1990.

6.Комиссаров И.В., Абрамец И.И., Самойлович И.М. Триптамин как эндогенный модулятор чувствительности нейронов к серотонину. Нейрофизиология 1989; 21: 3: 352—357.

7.Кукуев Л.А., Сергутина А.В., Герштейн Л.М. Патохимические изменения двигательных структур мозга под влиянием введения препаратов L-ДОФА и их отмены (экспериментальное исследование). Журн невропатол и психиат 1994; 94: 5: 28—32.

12.Селье Г. Стресс без дистресса. М: Прогресс 1982.

13.Сергутина А.В., Герштейн Л.М. Связь морфохимической пластичности мозга с поведенческими особенностями животных. Материалы Международных чтений: Фундаментальные и клинические аспекты интегративной деятельности мозга. Конференция к 100-летию Э.А. Асратяна: Тезисы. М 2003; 201—202.

14.Сергутина А.В., Рахманова В.И. Влияние пептида дельта-сна на активность некоторых ферментов в структурах мозга, чувствительных к стрессу крыс Август (цитохимическое исследование). Нейрохимия 1998; 15: 3: 303—307.

15.Симонов П.В. Эмоциональный мозг. М: Наука 1981.

16.Симонов П.В. Мотивированный мозг. М: Наука 1987.

17.Судаков К.В. Индивидуальная устойчивость к эмоциональному стрессу. Рязань: Горизонт 1998.

18.Эмоциональный стресс: теоретические и клинические аспекты. Под ред. К.В. Судакова, В.И. Петрова. Волгоград: Комитет по печати и информации 1997.

19.Douglas R.I. Pavlovian conditioning in the brain. In: Inhibition and Learning. Eds. R.A. Boakes, M.S.L. Hallidey. NY: Acad Press 1972; 529—553.

20.Garau A., Garsia-Sevilla L. Personality in rats and pain measures. Person and Individ Differ 1986; 7: 4: 567—569.

8.Кулагин Д.А., Болондинский В.К. Нейрохимические аспекты эмо21. Garsia-Sevilla L. Extraversion and neurotism in rats. Person and In-

циональной реактивности и двигательной активности крыс в новой обстановке. Успехи физиол наук 1986; 17: 1: 92—109.

9.Отмахов Н.А. Нейрональная сеть гиппокампа: морфологиче- ский анализ. Успехи физиол наук 1993; 24: 4: 79—101.

10.Павлов И.П. Двадцатилетний опыт объективного изучения высшей нервной деятельности (поведения) животных. М: Наука 1973.

11.Попова Н.С., Сергутина А.В., Герштейн Л.М. Взаимосвязь поведения и морфохимического состояния корково-подкорковых структур мозга у крыс Август и Вистар при действии L-ДОФА. Всероссийская конференция «Пластичность и структурно-функ- циональная взаимосвязь коры и подкорковых образований мозга»: Тезисы. М: Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева 2003; 74.

divid Differ 1984; 5: 5: 511—532.

22.Glenner G.G., Burtner H.I., Brown G.W. The histochemical demonstration of monoaminoxidase activity by tetrazolium salts. J Histochem Cytochem 1957; 5: 6: 591—600.

23.Juorio A.V., Paterson I.A. Tryptamine may couple dopaminergic and serotonergic transmission in the brain. Gen Pharmac 1990; 21: 5: 613—616.

24.Karnovsky M.J., Roots J. A direct colouring method for cholinesterases. J Histochem Cytochem 1964; 12: 3: 219—221.

25.Rubinstein L.J., Klatso J., Miguel J. Histochemical observations on oxidative enzyme activity of glial cells in a local brain injury. J Neuropathol Exp Neurol 1962; 21: 116—136.

Поступила 27.05.04

ЖУРНАЛ НЕВРОЛОГИИ И ПСИХИАТРИИ, 12, 2004

59

Соседние файлы в папке 2004