Журнал неврологии и психиатрии / 2007 / NEV_2007_03_07

ответственных за развитие наследственно-семейных форм первичного паркинсонизма, в том числе 4 гена для аутосомно-доминантных и 3 для аутосомно-ре- цессивных вариантов болезни [4, 22, 25, 30]. До последнего времени основным геном, мутации которого чаще всего связаны с семейными формами паркинсонизма, считался ген паркин (локус PARK2), расположенный в хромосомной области 6q25—27 [4, 18]. При этом мутациями паркина были обусловлены

âпервую очередь случаи аутосомно-рецессивного ювенильного паркинсонизма: показано, что повреждения гена паркина выявляются более чем в половине семейных и в 15—18% спорадических случаев паркинсонизма с началом в юношеском возрасте [1, 18, 20] и значительно реже у пациентов старше 30—40 лет [20]. Роль паркина и других генов в развитии «классических» поздних случаев болезни Паркинсона, особенно если отсутствует семейный анамнез, остается не до конца выясненной.

Сравнительно недавно — в 2004 г. двумя независимыми группами был идентифицирован новый ген

— LRRK2 (Leucine-rich repeat kinase 2), ответственный за развитие аутосомно-доминантных случаев болезни Паркинсона, сцепленных с локусом PARK8 на хромосоме 12q12 [22, 30]. Белковый продукт гена дардарин с мол. массой 286 кДа является высококонсервативной цитоплазматической ГТФ-зависимой киназой, предположительно вовлеченной в процессинг нейрональных белков и функционирование митохондрий [11]. Спектр PARK8-ассоциированных фенотипов весьма широк — от типичной поздней болезни Паркинсона с тельцами Леви до атипичных вариантов синуклеин- и тау-патологии [27, 30]. Такой полиморфизм существенно затрудняет выработку четких показаний к проведению мутационного скрининга гена LRRK2 у пациентов с болезнью Паркинсона либо другими дегенеративными паркинсоновскими синдромами.

Показано, что мутации гена LRRK2 могут вносить существенный вклад в этиологию как семейных, так и (что особенно важно) спорадических вариантов болезни Паркинсона. Согласно данным некоторых последних работ, выполненных в ряде популяций мира, суммарная частота мутаций в гене LRRK2 может составлять 1,7—13% при семейных и 0,4—2,7% при спорадических случаях болезни Паркинсона [5, 9, 10, 12, 16, 19, 23, 28]. Более того, эти оценки занижены, поскольку в связи со значительным размером гена LRRK2 (51 экзон) проведенный в большинстве исследований скрининг базировался лишь на анализе отдельных наиболее часто мутирующих экзонов либо даже отдельных мутаций.

Скрининг гена LRRK2 существенно облегчается

âсвязи с наличием в нем так называемых мажорных мутаций, т.е. с высокой частотой встречающихся в различных популяциях. Наиболее частой мажорной мутацией в гене LRRK2 является нуклеотидная замена 6055G>T в 41-м экзоне LRRK2, ведущая к замещению глицина (G) на серин (S) в белковой позиции 2019 [6, 9, 12, 16, 19, 21]. При болезни Паркинсона данная мутация G2019S встречается с частотой 0,4—10% в зависимости от наличия или отсутствия семейного анамнеза [11]. В некоторых популяциях ее

ГЕНЕТИКА БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА

частота может быть существенно выше в связи с эффектом основателя, как это имеет место, например, в североафриканских семьях с аутосомно-доминант- ной болезнью Паркинсона, в которых мутация LRRK2-G2019S встречается у 41% пробандов [17].

Сказанное демонстрирует значимость мутационного анализа гена LRRK2 у пациентов с разными вариантами болезни Паркинсона. В настоящей работе мы представляем первые полученные в России результаты исследования мажорной мутации LRRK2G2019S в большой невыборочной серии спорадиче- ских и семейных случаев болезни Паркинсона.

Материал и методы

Больные и семьи. Обследованы 311 пациентов с болезнью Паркинсона, диагностированной в соответствии с общепринятыми критериями [15]. Среди больных, представлявших преимущественно славянские популяции европейской части России, были 143 муж- чины и 168 женщин в возрасте от 33 до 84 лет (55,7±14,2 года); возраст манифестации симптомов заболевания составил от 29 до 75 лет (47,9±13,4 года). Обследовали также 5 клинически здоровых лиц — ближайших родственников больных с выявленной мутацией LRRK2-G2019S. Среди обследованных пациентов с болезнью Паркинсона было 295 споради- ческих случаев (отсутствие семейного анамнеза), а также 16 (5,4%) с достоверным или вероятным ауто- сомно-доминантным наследованием болезни Паркинсона (в каждой семье было как минимум 2 больных из двух последовательных поколений родословной). Клинико-генетические особенности большинства этих семейных случаев болезни Паркинсона описаны нами ранее [2].

Âкачестве контроля обследовали 350 неврологи- чески здоровых лиц (700 контрольных хромосом), соответствующих основной группе по возрастному и половому составу.

Молекулярно-генетический анализ. Геномную ДНК выделяли из 5—10 мл свежей или замороженной венозной крови стандартными методами. Детекцию нуклеотидной замены 6055G>T в 41-м экзоне гена LRRK2 (мутация G2019S) осуществляли с использованием праймеров и зонда для полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном режиме времени (real-time PCR) в соответствии с описанным протоколом [16]. ПЦР проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержавшей 10—20 нг геномной ДНК, 1½ПЦР буфер (Syn-

tol, Москва), 2,5 мM MgCl2, 10 пM каждого праймера, 200 мкM каждого из набора дезоксинуклеотидтрифосфатов, 1,25 ед. Hot-rescue Taq ДНК-полимера- зы (Syntol, Москва), а также 4 пM зонда, синтезированного на основе TaqMan-химии (Syntol, Москва). Амплификацию выполняли по следующему протоколу: 2 мин при 50°C, 10 мин при 95°C и далее 40 циклов по 15 с при 95°C и 50 с при 60°C. Интенсивность флюоресценции ПЦР-продуктов оценивали на приборе ANA-32 (Syntol, Москва).

Âсемейных случаях болезни Паркинсона и небольшой части спорадических носительство мутации LRRK2-G2019S осуществляли с помощью стандартного сайтспецифичного SfcI-рестрикционного теста [14].

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ

Для анализа гаплотипов у носителей мутации LRRK2-G2019S и их ближайших родственников (родителей и/или детей) были генотипированы два микросателлитных (D12S2516, D12S2518) и четыре однонуклеотидных (rs7966550, rs1427263, rs11176013, rs11564148) SNP-полиморфизма, тесно сцепленные с локусом PARK8 на хромосоме 12q12 [16]. Для микросателлитных маркеров ПЦР проводили в стандартных условиях, а продукты реакции разделялись в 8% полиакриламидном геле с визуализацией серебром; для SNP-маркеров осуществляли прямое секвенирование ПЦР-продуктов.

Генотипирование по ε2—ε4-полиморфизму аполипопротеина Е (AроE) проводилось в соответствии со стандартным протоколом [26].

Результаты и обсуждение

При обследовании 311 пациентов с болезнью Паркинсона нами были выявлены три случая гетерозиготного носительства мутации G2019S в гене LRRK2 (~1% от общего числа обследованных пациентов). Два носителя мутации G2019S не имели семейного анамнеза, а один носитель был членом семьи с четким аутосомно-доминантным наследованием болезни Паркинсона (родословная этой семьи представлена на рисунке). Таким образом, в нашей серии частота мутации LRRK2-G2019S составила 0,7% среди больных со спорадической болезнью Паркинсона и 6,3% среди ее семейных (аутосомно-доминантных) случа- ев. Это соответствует средней частоте PARK8-формы болезни Паркинсона и связанной с ней наиболее распространенной мутации в большинстве исследованных популяций [9, 10, 12, 16, 19, 28]. Мутация LRRK2-G2019S была выявлена также у 3 клинически здоровых родственников больных — двоих детей и сестры; эти лица входят в группу высокого риска (пенетрантность гена составляет около 70%) и нуждаются в тщательном динамическом наблюдении.

Ни у кого из лиц контрольной группы мутация G2019S в гене LRRK2 не была обнаружена, что подтверждает неслучайный характер выявленной ассоциации между данной нуклеотидной заменой и болезнью Паркинсона.

Клинические характеристики болезни у G2019Sпозитивных пациентов представлены в табл. 1. В этот

Родословная семьи Н. с идентифицированной мутацией G2019S в гене LRRK2.

Черные символы — члены семьи, страдающие болезнью Паркинсона; стрелка — пробанд; зачеркнутые символы — умершие.

анализ мы включили данные пациентов I-2 и II-2 из семьи Н. (см. рисунок): хотя их ДНК была недоступна для анализа, оба они с высокой вероятностью были носителями той же мутации, что и их тестированный родственник — пациент II-3. Как видно из табл. 1, все больные с мутацией LRRK2-G2019S имели в целом типичный фенотип болезни Паркинсона: у них развивался леводопачувствительный паркинсонизм с асимметричным началом симптомов и вариабельной комбинацией брадикинезии, ригидности и тремора покоя. Более редкими проявлениями были постуральная неустойчивость, дистония и леводопаиндуцированные дискинезии; когнитивные и вегетативные расстройства у больных отсутствовали.

Интересно отметить, что у всех членов семьи Н. выраженным и ранним симптомом болезни был постуральный тремор. В этой же семье возраст появления симптомов в младшем поколении у сибсов (55 и 57 лет) был достоверно меньшим, чем у их больной матери (71 год); аналогичные данные об антиципации в некоторых PARK8-семьях представлены и другими авторами [8]. Однако значимость указанных характеристик для дифференцирования PARK8-паркин- сонизма и других форм первичного паркинсонизма требует подтверждения на большем числе наблюдений.

Для объяснения показанной в табл. 1 выраженной вариабельности возраста начала болезни у носителей мутации LRRK2-G2019S (от 39 дo 71 года) мы протестировали ген АроЕ — один из наиболее известных модификаторов возраста манифестации симптоматики при болезни Паркинсона и других нейродегенеративных заболеваниях [29]. Оказалось, что все больные являются носителями одного и того же наиболее частого в популяции генотипа АроЕ — ε3/ε3. Следовательно, вариабельность возраста начала болезни при PARK8-форме болезни Паркинсона определяется другими, пока не идентифицированными генетическими либо средовыми факторами.

Для оценки происхождения мутации G2019S в гене LRRK2 у российских пациентов с болезнью Паркинсона мы реконструировали их гаплотипы, охватывающие 6 ДНК-маркеров в локусе PARK8 (табл. 2). Было установлено, что два пациента являются носителями одного и того же описанного в Европе G2019Sсцепленного гаплотипа [16], тогда как третий — больной Н. II-3 имеет другой гаплотип, четко различающийся по маркеру rs1427263 (см. табл. 2). Можно заключить, что мутация G2019S в двух подгруппах наших больных возникла независимо на разных хромосомах. Этот факт противоречит имеющимся в литературе данным [13] о наличии общего основателя (предшественника) у европейских больных — носителей мутации G2019S; наши результаты, напротив, свидетельствуют о возможности повторных мутационных событий и существовании «горячей точки» мутаций в кодоне 2019 гена LRRK2.

Таким образом, проведенное исследование подтвердило широкую распространенность мутации G2019S в гене LRRK2 при болезни Паркинсона, продемонстрировав ее существование и у российских больных. Идентификация мутаций в гене LRRK2 в определенной части случаев болезни Паркинсона

ЛИТЕРАТУРА

1.Загоровская Т.Б., Иллариошкин С.Н., Сломинский П.А. и др. Кли- нико-генетический анализ ювенильного паркинсонизма в России. Журн неврол и психиат 2004; 104: 8: 66—72.

2.Иванова-Смоленская И.А., Маркова Е.Д., Загоровская Т.Б., Иллариошкин С.Н. Семейные случаи болезни Паркинсона (клини- ко-генетический анализ). Мед генетика 2002; 5: 234—237.

3.Иллариошкин С.Н. Конформационные болезни мозга. М: Янус- К 2002.

4.Иллариошкин С.Н., Загоровская И.А., Иванова-Смоленская И.А., Маркова Е.Д. Генетические аспекты болезни Паркинсона. Неврол журн 2002; 5: 47—51.

5.Berg D., Schweitzer K.J., Leitner P. et al. Type and frequency of mutations in the LRRK2 gene in familial and sporadic Parkinson’s disease. Brain 2005; 128: 3000—3011.

6.Deng H., Le W., Guo Y. et al. Genetic and clinical identification of Parkinson’s disease patients with LRRK2 G2019S mutation. Ann Neurol 2005; 57: 933—934.

7.DeRijk M.C., Breteler M.M., Graveland G.A. et al. Prevalence of Parkinson’s disease in the elderly: the Rotterdam study. Neurology 1995;

45:2143—2146.

8.Di Fonzo A., Rohé C.F., Ferreira J. et al. A frequent LRRK2 gene mutation associated with autosomal dominant Parkinson’s disease. Lancet 2005; 365: 412—415.

9.Di Fonzo A., Tassorelli C., De Mari M. et al. Comprehensive analysis of the LRRK2 gene in sixty families with Parkinson’s disease. Eur J Hum Genet 2006; 14: 322—331.

10.Farrer M., Stone J., Mata I.F. et al. LRRK2 mutations in Parkinson disease. Neurology 2005; 65: 738—740.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ

11.Foroud T. LRRK2: both a cause and a risk factor for Parkinson’s disease? Neurology 2005; 65: 664—665.

12.Gilks W.P., Abou-Sleiman P.M., Gandhi S. et al. A common LRRK2 mutation in idiopathic Parkinson’s disease. Lancet 2005; 365: 415— 416.

13.Goldwurm S., Di Fonzo A., Simons E.J. et al. The G6055A (G2019S) mutation in LRRK2 is frequent in both early and late onset Parkinson’s disease and originates from a common ancestor. J Med Genet 2005; 42: e65.

14.Hernandez D.G., Paisan-Ruiz C., McInerney-Leo A. et al. Clinical and positron emission tomography of Parkinson’s disease caused by LRRK2. Ann Neurol 2005; 57: 453—456.

15.Hughes A.J., Daniel S.E., Kilford L., Lees A.J. Accuracy of clinical diagnosis of idiopathic Parkinson’s disease: a clinico-pathological study of 100 cases. J Neurol Neurosurg Psychiat 1992; 55: 181— 184.

16.Kachergus J., Mata I.F., Hulihan M. et al. Identification of a novel LRRK2 mutation linked to autosomal dominant parkinsonism: evidence of a common founder across European populations. Am J Hum Genet 2005; 76: 672—680.

17.Lesage S., Ibanez P., Lohmann E. et al. G2019S LRRK2 mutation in French and North African families with Parkinson’s disease. Ann Neurol 2005; 58: 784—787.

18.Lücking C.B., Dürr A., Bonifati V. et al. Association between earlyonset Parkinson’s disease and mutations in the parkin gene. New Engl J Med 2000; 342: 1560—1567.

19.Mata I.F., Ross O.A., Kachergus J. et al. LRRK2 mutations are a common cause of Parkinson’s disease in Spain. Eur J Neurol 2006;

13:391—394.

20.Morrison K.E. Parkin mutations and early onset parkinsonism. Brain 2003; 126: 1250—1251.

21.Nichols W.C., Pankratz N., Hernandez D. et al. Genetic screening for a single common LRRK2 mutation in familial Parkinson’s disease. Lancet 2005; 365: 410—412.

22.Paisan-Ruiz C., Jain S., Evans E.W. et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson’s disease. Neuron 2004; 44: 595—600.

23.Paisan-Ruiz C., Lang A.E., Kawarai T. et al. LRRK2 gene in Parkinson disease: mutation analysis and case control association study. Neurology 2005; 65: 696—700.

24.Veldman B., Wijn A., Knoers N. et al. Genetic and environmental risk factors in Parkinson’s disease. Clin Neurol Neurosurg 1998; 100: 15—26.

25.Vila M., Przedborski S. Genetic clues to the pathogenesis of Parkinson’s disease. Nat Med 2004; 10: Suppl: S58—S62.

26.Wenham P., Price W., Blandell G. Apolipoprotein E genotyping by one-stage PCR. Lancet 1991; 337: 1158—1159.

27.Wszolek Z.K., Pfeiffer R.F., Tsuboi Y. et al. Autosomal dominant parkinsonism associated with variable synuclein and tau pathology. Neurology 2004; 62: 1619—1622.

28.Zabetian C.P., Samii A., Mosley A.D. et al. A clinic-based study of the LRRK2 gene in Parkinson disease yields new mutations. Neurology 2005; 65: 741—744.

29.Zareparsi S., Kaye J., Camicioli R. et al. Modulation of the age at onset of Parkinson’s disease by apolipoprotein E genotypes. Ann Neurol 1997; 42: 655—658.

30.Zimprich A., Biskup S., Leitner P. et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron 2004; 44: 601—607.