Добавил:
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
Методы / 14.doc
Скачиваний:
98
Добавлен:
19.06.2017
Размер:
184.83 Кб
Скачать

Методическая разработка № 14

ТЕМА: Иммунологические методы диагностики. Реакции лизиса: бактериолиза, цитолиза (гемолиза), РСК, РТСК; реакции нейтрализации: токсина антитоксином ин витро и ин виво; реакции преципитации в геле, жидкой среде; иммуноферментный (ИФА); радиоиммунный (РИМ); реакция иммуноблоттинга (РИБ); реакция нейтрализации вирусов в культуре ткани (ЦПД, цветная проба).

Мотивационная характеристика темы:Реакции лизиса, относят к наиболее специфичным, сугубо иммунологическим методам. Обе фазы реакции происходят только лишь в том случае, когда имеет место полное соответствие антигена антителу. Для правильного течения реакции необходимы четкие количественные соотношения, для чего используют ингредиенты с заранее определенными титром и рабочей дозой. Другие реакции преципитации, нейтрализации с несколькими вариантами также подчиняются аналогичным законам, но отличаются дополнительными компонентами, условиями, характером результата. Диапазон применения этих реакций огромен, от санитарно-гигиенического контроля, определения фальсификации продуктов, диагностики до судебной экспертизы. Знакомство с ними – главное назначение темы.

УЧЕБНАЯ ЦЕЛЬ:

Продемонстрировать варианты практического использования учения об иммунитете в иммунодиагностике. Научить разным методам, пониманию их сущности, технике постановки и расшифровке результатов обследования пациентов с помощью современных иммунодиагностических проб.

ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ ПОДГОТОВКИ И ВВОДНОГО

КОНТРОЛЯ ЗНАНИЙ

1. Комплемент, его структура, функции, участие в иммунных реакциях лизиса.

2. Классический и альтернативный путь активации.

3. Реакция гемолиза, сущность, техника, назначение как индикатора.

4. Реакция бактериолизиса ин витро. Ингредиенты, схема постановки, правила учета.

5. Реакция бактериолизиса ин виво (феномен Исаева-Пфейффера).

6. Реакция связывания комплемента (РСК): определение титра и рабочей дозы комплемента, антигена, гемолитической сыворотки, схема постановки реакции, этапы, оценка результатов. РТСК, сущность, назначение.

7. Реакция нейтрализации токсина антитоксином. Определение токсина, его силы, титра антитоксической сыворотки, варианты постановки реакций: ин витро – флокуляция, ин виво.

8. Варианты постановки реакции нейтрализации в вирусологии; на лабораторных животных, в культуре ткани, на развивающихся куриных эмбрионах. Особенности учёта, индикаторы.

9. Реакции преципитации в пробирках, капиллярах геле. Приготовление антигена.

10. Иммунологические реакции с меченными диагностическими компонентами: иммуноферментный метод диагностики (ИФА), радиоиммунный метод (РИМ), иммуноблоттинг (ИБ).

11. Критерии серо- или иммунодиагностики: диагностический титр, нарастание титра антител, специфическое подавление (торможение).

12. Определение периода болезни с помощью иммунодиагностики (раздельное определение иммуноглобулинов М и G) с учетом сроков и уровня их появления.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ВЫПОЛНЕНИЮ ПРАКТИЧЕСКОЙ РАБОТЫ С ПОЛНЫМ РЕГЛАМЕНТОМ ПРОТОКОЛА ЗАНЯТИЯ И ЕГО ОФОРМЛЕНИЕМ

Наименование учебного элемента (задания)

Методическое решение

Регламент протокола

1.

Механизм реакции связывания комплемента - РСК

Приложение 1

Учебная литература

Зарисовать схему в протокол.

Прочесть и оценить

2.

Подготовительное титрование:

а) комплемента

б) антигена

в) гемолитической сыворотки

Приложение 2

Приложение 3

Приложение 4

Записать в протокол схемы

3.

Приготовление гемолитической системы (индикаторной системы)

Приложение 5

Записать в протокол схемы

4.

Постановка реакции торможения РСК - РТСК

Приложение б

Записать в протокол и оценить результат готовой реакции

5.

Реакция нейтрализации бактери- альных токсинов:

а) определение токсигенности

б) определение титра анатоксина и антитоксической сыворотки

Приложение 7

Приложение 8,9

Записать в протокол схемы постановки и оценить готовые результаты

6.

Реакция преципитации в жидкой среде и геле

Приложение 10

Записать в протокол, зарисовать

7.

Радиоиммунологический метод (РИМ)

Приложение 11

Записать в протокол

8.

Иммуноферментный метод анализа

(ИФА)

Приложение 12

Записать в протокол схему и результат

9.

Метод иммуноблоттинга

Приложение 13

Заполнить и записать в протокол

10.

Итоговый тестовый контроль

Приложение 14.

Приложение 1

Схема постановки основного опыта РСК

Ингредиенты

Опыт

Контроль сыворотки

Контроль антигена на антикомпле-ментарность

Контроль антигена на гемотоксичность

1. Диагностическая система

Сыворотка крови больного, инактивированная при +56 C° 30 мин., мл

0,5

0,5

-

-

Антиген в рабочей дозе, мл

0,5

-

0,5

0,5

Комплемент в рабочей дозе, мл

0,5

0,5

0,5

-

Физ. раствор 0,85 %

-

0,5

0,5

1,0

Инкубировать в термостате при 37 C° 60 мин.

2. Индикаторная система (гемолитическая)

Гемолитическая сыворотка в рабочей дозе, мл

0,5

0,5

0,5

0,5

Эритроциты барана 3 % взвесь, мл

0,5

0,5

0,5

0,5

Инкубировать в термостате при 37С° 60 мин.

Соединить IиIIсистемы Выдержать при +37С° 60 мин.

Результаты РСК (пример)

+ + + +

-

-

-

Результат гемолиза

-

+

+

-

Оценку РСК проводят по четырехплюсовой системе:

+ + + + Полная задержка гемолиза, эритроциты в осадке, надосадочная жидкость прозрачная; резко положительная РСК.

+ + + Неполная задержка гемолиза, эритроциты в осадке, надосадочная жидкость прозрачная, слабо розового цвета; положительная РСК.

+ + Частичная задержка гемолиза, осадок эритроцитов незначительный, надосадочная жидкость красно-розового цвета, прозрачная; слабо положительная РСК.

+ Осадок незначительный, жидкость красная; сомнительная РСК.

- Полный гемолиз, прозрачная красная жидкость. Отрицательная РСК.

Приложение 2

СХЕМА ТИТРОВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (В ПРИСУТСТВИИ АНТИГЕНА)

Ингредиенты

Пробирки

Контроли антигена

1

2

3

4

5

6

Гемотокс.

Антикомпл

Комплемент

1:10

0,05

0,1

0,12

0,15

0,18

0,25

-

0,25

Физ.раствор, мл

0,45

0,4

0,38

0,35

0,32

0,25

0,5

0,25

Антиген, мл

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

Инкубировать в термостате при 37С° 40 мин.

Гемолитическая система, мл

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

Инкубировать в термостате при 37С° 40 мин.

Учет результатов

Задержка гемолиза

Гемолиз

Задержка гемолиза

Гемолиз

Титр комплемента 0,12 (минимальное количество, дающее гемолиз в гемосистеме).

Рабочая доза 0,15 (чуть больше титра, для гарантии).

Приложение 3

СХЕМА ТИТРОВАНИЯ АНТИГЕНА НА АНТИКОМПЛЕМЕНТАРНОЕ

Действие

Ингредиенты

Пробирки

Контроль антигена на гемотоксичность

1

2

3

4

5

6

7

Антиген, мл

0,05

0,1

0,15

0,18

0,20

0,23

0,25

0,25

Физ.раствор 0,85 %, мл

0,45

0,4

0,35

0,32

0,30

0,27

0,25

0,5

Комплемент 1:10, мл

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

-

Инкубировать в термостате при 37С° 40 мин.

Гемолитическая система, мл

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

Инкубировать в термостате при 37С° 40 мин.

Учёт результатов

Гемолиз

Задержка гемолиза

Задержка гемолиза

Титр антигена — то минимальное количество АГ, которое не мешает гемолизу. Это 0,18 мл. Рабочая доза должна быть в 2 раза меньше, это – 0,09 мл.

Приложение 4

СХЕМА ТЕТРИРОВАНИЯ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ

Ингредиенты

Пробирки

1

2

3

4

5

6

7

Физ. раствор 0,85 %, мл

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

Гемолитическая сыворотка 1:50, мл

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

В дез.р.

Разведение сыворотки

1:100

1:200

1:400

1:800

1:1600

1:3200

1:6400

Эритроциты барана 3 % взвесь, мл

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

Инкубировать в термостате при 37С° 40 мин.

С׀ 1:10 в раб. титре

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

Инкубировать в термостате при 37С° 40 мин.

Учёт результатов

Гемолиз

Задержка гемолиза

Титр гемолитической сыворотки — то максимальное разведение, которое даёт гемолиз. Это 1: 1600. Рабочий титр должен быть концентрированнее титра в 3-4 раза, т.е. рабочий титр - 1: 400.

Приложение 5

Приготовление гемолитической системы

1. Отдельно готовят 3% взвесь эритроцитов барана: З мл, отмытых в 0,85 % физиологическом растворе эритроцитов помещённых в 97 мл. физ. раствора.

2. В отдельной колбе готовят гемолитическую сыворотку с учетом рабочего титра.

3. К 3% взвеси эритроцитов барана добавляют равный объем гемолитической сыворотки в рабочем титре. Гемолитическая система готовится за 15-20 мин. до постановки реакции. Для, сенсибилизации подготовленную систему устанавливают в термостат при +37С° на 15-20 мин.

Приложение 6

Реакция торможения связывания комплемента - ртск

Принцип метода.При наличии неполных антител в сыворотке крови больного возможна блокада ими антигена (диагностикума) и получение ложных отрицательных результатов. Для контроля в этом случае ставят РТСК с применением в качестве дополнения заведомо положительной иммунной сыворотки с полными антителами.

Схема постановки РТСК

Ингредиенты

Опыт РСК

Контроль

положительн. АТ

Опыт РТСК

Сыворотка крови больного, инактивирована при + 56 С° 30 минут

0,5

-

0,5

Антиген в рабочей дозе, мл.

0,5

0,5

0,5

Физиол. раствор 0,85 %, мл.

-

0,5

-

Комплемент в рабочей дозе, мл.

0,5

0,5

0,5

Инкубировать при + 37С° 45 —60 минут

Заведомо положительная иммунная сыворотка, инактивированная при + 56 С° 30 мин.

-

0,5

0,5

Инкубировать при + 37С° 45 —60 минут

Гемосистема (готовая), мл

1,0

1,0

1,0

Инкубировать при + 37С° 45 —60 минут

Результат

Гемолиз

Гемолиза нет

Гемолиз

Условие: у больного есть неполные антитела.

Приложение 7

Тут вы можете оставить комментарий к выбранному абзацу или сообщить об ошибке.

Оставленные комментарии видны всем.

Соседние файлы в папке Методы