Методические указания к практической работе

Продолжительность занятия: 3 академических часа (135 минут)

Место проведения занятия: учебная аудитория

Материально-техническое оснащение – таблицы, стенды, микроскопы, микропрепараты, вакцины

Хронометраж практического занятия:

1. Вводное слово преподавателя – 5 мин

2. Проверка исходного уровня знаний (тест-контроль) – 15 мин

3. Разбор теоретических вопросов по теме «Clostridium perfringens»

– 25 мин

1. Характеристика возбудителей анаэробной раневой инфекции

2. Патогенез заболевания

3. Лабораторная диагностика анаэробной раневой инфекции

4. Специфическая профилактика и терапия раневой инфекции

4. Разбор теоретических вопросов по теме «Clostridium tetani» – 25

мин

1. Характеристика возбудителей столбняка

2. Эпидемиология и патогенез столбняка

3. Лабораторный диагноз столбняка

4. Специфическая профилактика и терапия столбняка

5. Разбор теоретических вопросов по теме «Clostridium botulinum» –

30 мин

1. Характеристика палочек ботулизма

2. Токсинообразование у палочек ботулизма

3. Эпидемиология и патогенез ботулизма

4. Лабораторная диагностика ботулизма

5. Специфическая профилактика и терапия ботулизма

6. Выполнение практической работы – 35 мин

Практическая работа

Clostridium perfringens

1. Изучение мазка из чистой культуры Cl.perfringens, окрашенного по Граму (зарисовать)

В поле зрения видны крупные полиморфные грамположительные палочки (старые клетки грамотрицательные) с закругленными концами. Видны споры овальной формы, превышающие диаметр палочки, расположенные центрально или субтерминально (зарисовать).

2. Изучение колонии клостридий в глубине агара в пастеровских пипетках (зарисовать)

Сделан посев почвы на сахарный агар, расплавленный и остуженный до 45 °. После перемешивания агара, им наполняют пастеровские пипетки путем насасывания. Тонкий конец запаивают. После суточного инкубирования в глубине агара вырастают колонии в виде чечевичных зерен, расположенные под углом друг к другу в виде «парашютиков», «самолетиков» или в виде пушинок и комочков ваты. При обнаружении подозрительных колоний пипетку распиливают, а колонию отсевают на среду Китта-Тароцци.

3. Изучение среды Китта-Тароцци (зарисовать, указать ингредиенты)

Это специальная среда для культивирования анаэробов, содержит питательный бульон, которым заливают кусочки печени или мяса. В качестве редуцирующего вещества добавляют 0,5% глюкозы. Перед посевом среду кипятят, быстро остужают до 45 °, засевают, не дав среде насытиться кислородом, и заливают слоем вазелинового масла. При росте клостридий среда мутнеет, может наблюдаться газообразование (зарисовать, записать ингредиенты)

4. Изучение анаэростата

Анаэростат - это прибор, в котором осуществляют культивирование анаэробов. Он герметически закрывается, из него выкачивают воздух, оставляют вакуум или замещают его индифферентным газом или смесью азота и углекислого газа. Этот аппарат можно использовать для химического поглощения кислорода из воздуха. Для этого, после размещения чашек и пробирок с посевами, в него помещают вещества, поглощающие кислород, и герметически его закрывают

5. Изучение микробиологического диагноза анаэробной раневой инфекции по схеме (записать в тетрадь)

Анаэробная раневая инфекция - тяжелое острое поликлостридиальное заболевание, осложняющее течение травм (ожогов, ранений, отморожений). Раневая инфекция может быть вызвана клостридиями, как ассоциацией клостридий, так и смесью патогенных и апатогенных клостридий с аэробными бактериями. Клостридии газовой гангрены, благодаря продукции ферментов и экзотоксинов, обладают высокой токсигенностью.

Микробиологическая диагностика может быть использована для коррекции серотерапии. В качестве материала для исследования собирают экссудат из раны, кусочки измененной ткани из раны, инородные тела, попавшие в рану, кровь. Микробиологическое исследование направлено на выделение клостридий или выявление их токсинов.

Основными методами микробиологического исследования являются:

- микроскопический;

- бактериологический;

- биологический

Микроскопический метод. Из патологического материала готовят мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют. Обнаружение в мазках грамположительных коротких с обрубленными концами, окруженных капсулой палочек позволяет ориентировочно диагностировать Cl.perfringens. При соответствующей клинической картине в этом случае бактериоскопия имеет диагностическое значение. Если в препарате обнаружены палочки другой морфологии, ориентировочного ответа не дают.

Cl.novyi представляют собой палочки до 10 мкм длиной, 1 мкм шириной, несколько искривленные с закругленными концами. Похожи на них, но несколько короче и тоньше, Cl.septicum. У этого микроба часто наблюдается полиморфизм, имеются нитевидные формы. Оба вида капсулу не образуют. У Cl.histolyticum нет особых морфологических признаков, при анаэробной инфекции этот возбудитель встречается редко. При микроскопии обращают внимание на сопутствующую аэробную флору, так как она осложняет инфекционный процесс. Учитывая быстрое развитие клиники, необходимо быстро дать ориентировочный ответ. Для этого используют метод иммунофлюоресценции.

Бактериологический метод. Бактериологический метод применяют для выделения культуры клостридий. Для этого исследуемый материал засевают на специальные среды, обеспечивающие рост анаэробов: сахарный агар, кровяно-сахарный агар, среды Китта-Тароцци, Вильсон-Блера, инкубируют в термостате или эксикаторе. Посевы в пробирки дублируют, потому что для уничтожения аэробных микробов один экземпляр посевов прогревают. Посевы наблюдают 8 дней, просматривая их каждые 2 дня. Изучают выросшие колонии. На среде Вильсон-Блера колонии черного цвета. На кровяном агаре колонии круглые, гладкие с зеленоватой зоной гемолиза (Cl.perfringens), шероховатые с гемолизом (Cl.novyi, Cl.oedematiens), мелкие гладкие без гемолиза (Cl.histolyticum), с нежным кружевным ростом и гемолизом (Cl.septicum). В столбике с сахарным агаром вырастают дискообразные колонии (Cl.perfringens), пушистые с плотным центром (Cl.novyi, Cl.oedematiens), хлопьевидные (Cl.septicum), мелкие, плотные, комочками (Cl.histolyticum).

После микроскопии подозрительных на анаэробы колоний делают пересев отдельных колоний на среду Китта-Тароцци для получения чистой культуры. Чистую культуру идентифицируют по биохимическим (табл.1), антигенным и токсигенным свойствам.

Токсигенные свойства определяют путем постановки биологической пробы на белых мышах. Для этого культуральную жидкость разливают в 6 пробирок и в каждую из 5 добавляют антитоксические противогангренозные сыворотки, в 6 пробирку добавляют физиологический раствор. Смесь выдерживают при комнатной температуре 40 минут и вводят внутривенно белым мышам. При соответствии токсина и антитоксина произойдет нейтрализация токсина и мыши, которым введена нейтральная смесь, останутся живыми, контрольные же погибнут.

Биологический метод. Биологический метод используется для обнаружения токсина в крови и другом исследуемом материале. Для этого материал смешивают с антитоксическими противогангренозными сыворотками: анти-перфрингенс, анти-эдематиенс, анти-вибрио, анти-гистолитикум, анти-сордели, для контроля материал смешивают с физиологическим раствором. Смесь выдерживают 40 минут для взаимодействия и вводят внутрибрюшинно белым мышам. Видовую принадлежность токсина устанавливают по выжившим мышам, при гибели мышей контрольной и остальных опытных групп.

В случае гибели всех мышей реакцию нейтрализации повторяют с типовыми А, В, Д, Е диагностическими сыворотками Cl.perfringens. Вместо мышей можно брать морских свинок, монослой культуры клеток или 10-дневные куриные эмбрионы. При ускоренной диагностике определяют тип токсина в исследуемом материале реакцией преципитации в геле, нейтрализации антителами лецитиназной активности клостридий, изменение морфологии и культуральных свойств при выращивании клостридий в присутствии специфических антител.

Таблица 1