Методические указания к практической работе

Продолжительность занятия: 3 академических часа (135 минут)

Место проведения занятия: учебная аудитория

Материально-техническое оснащение – таблицы, стенды, микроскопы, микропрепараты, вакцины

Хронометраж практического занятия:

1. Вводное слово преподавателя – 5 мин

2. Проверка исходного уровня знаний (тест-контроль) – 15 мин

3. Разбор теоретических вопросов по теме – 50 мин

1. Характеристика стрептококков

2. Токсины и ферменты патогенности стрептококков

3. Современная классификация стрептококков

4. Роль стрептококков в патологии человека. Стрептококковые инфекции

5. Лабораторный диагноз острых стрептококковых инфекций

6. Лабораторный диагноз хронических стрептококковых инфекций

4. Разбор теоретических вопросов по теме – 30 мин

1. Пневмококки, их свойства

2. Формы пневмококковой инфекции

3. Эпидемиология пневмококковой инфекции

4. Лабораторная диагностика пневмококковой инфекции

5. Дифференциация пневмококков от зеленящих стрептококков

5. Выполнение практической работы – 35 мин

Практическая работа

1. Изучение мазка из чистой культуры стрептококка, окрашенного по Граму (зарисовать)

В мазке, окрашенном по Граму, видны грамположительные кокки, располагающиеся цепочками, иногда цепочки очень длинные, проходят через все поле зрения.

2. Изучение мазка из гноя, окрашенного по Граму (зарисовать)

На розовом фоне, который образует клеточный детрит, видны лейкоциты, а между ними грамположительные кокки, располагающиеся в виде коротких цепочек (3–4 кокка) или парами.

3. Изучение характера роста стрептококков на кровяном агаре (зарисовать):

По характеру роста на кровяном агаре стрептококки делятся на:

3.1. бета-гемолитические стрептококки, они образуют на кровяном агаре мелкие колонии с большой зоной полного просветления среды вокруг них. Бета-гемолизин действует на строму эритроцитов, разрушая их, поэтому в зоне гемолиза эритроциты не видны

3.2. альфа-гемолитические стрептококки, они растут на кровяном агаре в виде мелких сероватых колоний с гладкой или шероховатой поверхностью, окруженных полупрозрачной зеленоватой зоной гемолиза. Альфа-гемолизин действует на гемоглобин, превращая его в метгемоглобин. В зоне гемолиза под малым увеличением видны тени эритроцитов. Так как зона имеет зеленоватый цвет, эти стрептококки названы зеленящими.

3.3. негемолитические стрептококки, они образуют мелкие колонии, кровяной агар не изменяют.

4. Изучение лабораторной диагностики стрептококковых инфекций по схеме (зарисовать)

При острых формах стрептококковых инфекциях применяют методы:

- микроскопический

- бактериологический

При хронических заболеваниях используют

- серологический метод

Идентификация Str.рyogenes проводится на основании:

- морфологических особенностей роста

- фенотипических характеристик

• каталазная реакция

• определение чувствительности к бацитрацину

• постановка PYR-теста

- антигенной структуры (серологический метод)

Микроскопический метод. Метод основан на обнаружении стрептококков в исследуемом материале. Из гноя, отделяемого ран, осадка мочи готовят мазки, окрашивают их по Граму. Обнаружение грамположительных кокков в виде коротких цепочек или расположенных парами позволяет поставить ориентировочный диагноз.

Бактериологический метод. Метод основан на выделении чистой культуры стрептококка на питательных средах. Исследуемый материал засевают на плотные и жидкие питательные cреды. Питательные потребности стрептококков сложные, на МПА они не растут, особенно в первых генерациях. Поэтому используют для посева cреды с добавлением крови, сыворотки, углеводов. Более информативен посев на кровяной агар с 5% бараньих эритроцитов, так как на нем виден характер гемолиза. Материал с тампона размазывают по поверхности 5% кровяного агара, но не втирают его в агар. Затем ополаскивают тампон в сахарном бульоне. Посев крови проводят у постели больного с последующим высевом на кровяной агар. Все посевы помещают в термостат на 18-20 часов.

На следующий день просматривают посевы на жидких средах. При наличии роста делают пересев на кровяной агар. На жидких питательных средах патогенные стрептококки дают придонно-пристеночный рост с образованием мелкокрошковатого осадка, бульон остается прозрачным. В мазке культуры из бульона видны длинные цепочки грамположительных кокков. Просматривают колонии на кровяном агаре. Гемолитическая реакция является важной в идентификации пиогенного стрептококка. Гемолиз обусловлен действием кислородолабильного стрептолизина О. Str.рyogenes образует три типа колоний:

- матовые (круглые колонии серовато-белого цвета 1–2 мм в диаметре с характерным, слегка приподнятым центром);

- слизистые (колонии правильной круглой формы, блестящие, напоминающие своим видом капельки росы, диаметр колонии 2–2,5 мм). Такие микроорганизмы продуцируют много гиалуроновой кислоты;

- гладкие (относительно небольшие колонии 1 мм в диаметре, сферической формы, с ровным краем и блестящей влажной поверхностью).

Другие виды стрептококков, относящиеся к β-гемолитическим серогруппы А, формируют очень мелкие колонии, адкиее

ри типа колоний:ием стрептолизина Онтификации пиогенного стрпетококка. зона гемолиза вокруг них значительно превышает размеры колоний.

Для дальнейшего изучения, отбирают мелкие сероватые колонии, окруженные зоной полного гемолиза или зеленоватой зоной. Из подозрительных колоний готовят мазки, окрашивают их по Граму. В препарате видны грамположительные кокки, располагающиеся короткими цепочками по 2–4.

На принадлежность к роду стрептококков указывает морфология, характер роста на кровяном агаре и сахарном бульоне. Для определения принадлежности выделенной культуры к определенному виду проводят дополнительные исследования: фенотипические методы идентификации. Str.рyogenes дает отрицательную каталазную реакцию. Str.рyogenes обладает чувствительностью к антибиотику бацитрацину. Зона задержки роста ≥12 мм. Str.рyogenes продуцируют фермент пирролидонил пептидазу (PYR-аза), который разрушает L-пирролидонил в-нафтиламид при добавлении реагента (0,01% циннамальдегида), возникает красное окрашивание.

Серологический метод идентификации. Метод основан на выявлении группового полисахарида клеточной стенки. Этот полисахарид не является поверхностной структурой клеточной стенки. Для взаимодействия со специфическими антителами, содержащимися в сыворотке, необходимо провести экстракцию антигена. Экстракция может быть проведена с помощью кислоты или ферментов. Реакцию взаимодействия антигена с антителом определяют по видимой агглютинации (тест коагглютинации и латекс-агглютинации), по изменению цвета (хроматографический тест), либо по другим изменениям в зависимости конкретной тест-системы.

Дифференциацию стрептококков на серовары проводят только в группе А с помощью реакции иммунопреципитации по белковому антигену М. М – белок высокоспецифичный антигенный маркер и фактор вирулентности. Стрептококки можно типировать по Т-антигену с помощью реакции агглютинации.

Серологическая диагностика применяется при подтверждении диагноза, как правило, ревматизма. Она основана на обнаружении антител против стрептолизина О, антистрептокиназы, антидезоксирибонуклеазы В, антигиалуронидазы. Антистрептолизины определяют в реакции нейтрализации – способности стрептолизина О растворять эритроциты. Антигиалуронидазу и антифибринолизин также определяют в реакции нейтрализации.

Str.pneumoniae

1. Изучение мазка из чистой культуры Str.pneumoniae, окрашенного по Граму (зарисовать)

В мазках из чистых культур видны грамположительные ланцетовидные диплококки, иногда расположенные в виде коротких цепочек.

2. Изучение мазка из мокроты больного пневмонией, окрашенного по Граму (зарисовать)

В мазке, окрашенном по Граму, на розовом фоне клеточного детрита видны грамположительные ланцетовидные диплококки, окруженные бесцветной капсулой.

3. Изучение мазок-отпечаток из органов мыши, зараженной мокротой (зарисовать)

В мазке, окрашенном по Граму, на фоне клеточных элементов органов, окрашенных в розово-фиолетовый цвет, видны грамположительные ланцетовидные диплококки, окруженные бесцветной капсулой.

4. Изучение роста пневмококка на кровяном агаре (зарисовать)

Пневмококки образуют альфа-гемолизин, поэтому на кровяном агаре вырастают в виде полупрозрачных мелких нежных плоских колоний со слегка вдавленным центром за счет аутолиза, окруженные зеленоватой зоной гемометаморфоза.

5. Изучение тестов, дифференцирующих пневмококки от других видов по схеме (записать в тетрадь)

Так как по морфологии и характеру роста бывает трудно дифференцировать пневмококк от энтерококка и группы «зеленящих стрептококков», для их отличия рекомендуются оптохиновый, желчный и другие тесты (табл.12).

Таблица 12

Схема дифференциация Streptococcus и Enterococcus

Тест Вид микроба	Глюкоза	Маннит	Салицин	Инулин	40% желчь	Оптохин 1:50000	Желатин
Str. pneumoniae	К	–	–	К	лизис	чувстви- телен	не разжи жает
Стрептококки группы «Str.viridans»	К	К	К	–	гибель без лизиса	устойчив	не разжи жает
Е.faecalis	К	К	К	–	рост	устойчив	разжижает

Примечание: К – расщепление углеводов с образованием кислоты, (–) – отсутствие ферментации

6. Изучение схемы лабораторного диагноза пневмококковых инфекций по таблице (зарисовать)

Источником инфекции являются люди, у которых пневмококки обитают на слизистой дыхательных путей в норме или при различных заболеваниях. Главный фактор патогенности пневмококка является капсула полисахаридной природы. Пневмококки вызывают острую пневмонию у детей и взрослых. Способствуют развитию пневмонии предшествующие респираторные вирусные заболевания, патологическое скопление слизи и закупорка бронхов. Кроме того, пневмококки могут вызывать ползучую язву роговицы, отит, у маленьких детей они вызывают менингит, у части больных детей происходит генерализация процесса и возникает септицемия.

Для постановки лабораторного диагноза проводят микробиологическое исследование. Материал для исследования зависит от формы пневмококковой инфекции. Это может быть мокрота при пневмонии, отделяемое из язвы при ползучей язве роговицы или из уха при отите, спинномозговая жидкость при менингите, кровь при сепсисе, гной из абсцесса. Мокроту собирают в стерильные банки, лучше всего брать утреннюю мокроту. Перед откашливанием больной чистит зубы и полощет рот кипяченой водой, чтобы механически удалить остатки пищи, слущенный эпителий, микрофлору ротовой полости.

Отделяемое язвы или из уха берут стерильным тампоном, предварительно смочив его физиологическим раствором.

Гной из абсцесса собирают стерильным шприцем.

Кровь берут стерильным шприцем из локтевой вены в объеме 5–10 мл.

Материал доставляют в лабораторию. Интервал между взятием материала и его посевом не должен превышать 1–2 часов. Хранение материала способствует размножению сапрофитной флоры, развитию процессов гниения и брожения, что может исказить результаты анализа.

Основные методы микробиологического исследования:

- микроскопический;

- бактериологический;

- биологический

Микроскопический метод. Микроскопический метод основан на обнаружении возбудителя в мазках из исследуемого материала. Для этого из мокроты выбирают слизисто-гнойный комочек, растирают его на стекле, окрашивают по Граму и микроскопируют. Особенностью мокроты является обязательное наличие нескольких видов микроорганизмов, так как, проходя через верхние дыхательные пути и полость рта, мокрота может обсеменяться находящейся в них микрофлорой. В мазке видны скопления грамположительных, грамотрицательных кокков и палочек, как с капсулой, так и без нее, ланцетовидных диплококков, окруженных капсулой. Всегда можно обнаружить в мазке лейкоциты. Их отсутствие и большое количество эпителиальных клеток свидетельствует, что материал взят неправильно (с примесью слюны) и его нужно взять повторно. Спинномозговую жидкость, гной, пунктаты центрифугируют, из части осадка готовят мазки, окрашивают их по Граму. Иногда можно поставить диагноз при микроскопии материала. В мазке видны ланцетовидные грамположительные диплококки, окруженные капсулой. В спинномозговой жидкости, пунктатах часто пневмококк содержится в чистой культуре.

Бактериологический метод. Бактериологический метод основан на выделении пневмококка в чистой культуре.

В первый день исследования материал засевают на кровяной, сывороточный и шоколадный агар.

Так как пневмококки могут обитать в дыхательных путях и в норме, для оценки роли их в этиологии пневмонии проводят количественный посев. Для этого взятую мокроту гомогенизируют. Из полученного гомогенизата, готовят серию разведений в бульоне до 10⁷. Затем на кровяной и «шоколадный» агары высевают по 0,1 мл из разведений 10 ^-7 ,10 ^-5, 10^-3 и 10^-1.

Росту пневмококков способствует повышенное содержание углекислоты в окружающем воздухе. Приемы, позволяющие получить насыщение воздуха углекислотой, предложены разные. Они позволяют достигнуть от 5 до 20% углекислоты в воздухе. Чаще всего в лабораториях посевы помещают в эксикатор с горящей свечой и выдерживают в термостате при температуре 37 градусов 18–20 часов.

На второй день исследования изучают посевы. Сывороточный агар – колонии мелкие (диаметр до 1 мм) прозрачные, плоские с центральным углублением. «Шоколадный» агар – мелкие прозрачные колонии, окруженные зоной желтовато-зеленого альфа-гемолиза. Кровяной агар – мелкие плоские, прозрачные колонии, окруженные зеленящей зоной альфа-гемолиза. Из подозрительных колоний с зоной гемометаморфоза готовят мазки, окрашивают по Граму, исследуют под микроскопом. При наличии в мазках грамположительных диплококков оставшуюся часть колонии пересевают на кровяной агар для выделения чистой культуры, посевы помещают в термостат. При учете количественного посева изучают чашки с посевом материала в разведении десять в минус пятой степени. Это разведение является диагностическим.

На третий день после проверки чистоты культуры, окрашенной по Граму, проводят идентификацию выделенной культуры и дифференцируют ее от альфа-гемолитических стрептококков по чувствительности к желчи, оптохину и способности ферментировать инулин. Если выделенная культура ферментирует инулин, не растет на среде, содержащей оптохин (1:50000) и лизируется желчью, она относится к Str.pneumoniae (табл.13).

Определение серовара проводят в реакции агглютинации в пробирках с бульонной культурой и диагностической сывороткой в разведении 1:5 или в реакции ко-агглютинации на стекле, смешивая культуру, выросшую на кровяном агаре с диагностическим реагентом (культура стафилококка с адсорбированными на нем антипневмококковыми антителами). Наиболее часто от больных людей выделяют пневмококки I,II или III типов. О возбудителе судят на основании комплекса исследований: данные микроскопии первичных мазков, количественная оценка роста на плотных средах, учет анамнеза клинических проявлений и результаты терапии.

Таблица 13