Аудиторная работа.

Лабораторная работа. Определение активности каталазы.

Принцип метода: молибденовокислый аммоний с раствором перекиси водорода образует комплексное соединение желтого цвета. Каталаза разрушает перекись водорода по следующей формуле:

2Н ₂О₂ = 2Н ₂О + О ₂

Степень снижения интенсивности окраски раствора пропорциональна активности каталазы.

Ход работы: в опытную и контрольную пробирку вносят по 4 мл 0,03% раствора перекиси водорода, в опытную пробирку добавляют 0,2 мл гемолизированной крови ( разведение 1:1000). Ингибируют пробу 20 минут при 37⁰ С. Затем в обе пробирки вносят по 2 мл раствора молибдата аммония, а в контрольную – дополнительно 0,2 мл гемолизата. Перемешивают. Измеряют оптическую плотность опытной и контрольной пробы против воды при синем светофильтре. Определяют активность каталазы по формуле:

( Е _к – Е ₀) . 5600

А= -------------------, где

В

А –активность каталазы (мкмоль Н ₂О ₂/ мин на мл крови);

Е _к –экстинция контроля; Е ₀ – экстинция опыта;

В – время инкубации, мин; 5600 – коэффициент

В норме активность каталазы составляет 135 мкмоль Н ₂О ₂/ мин на мл

крови (в слюне –12-16 мкмоль). Активность каталазы в крови может снижаться при анемии, опухолевом росте, туберкулезе, некоторых других заболеваниях, а повышаться при острых воспалительных процессах ( в слюне – при воспалительных процессах слизистой ротовой полости).

Аргументировано и кратко ответить на следующее:

1. Может ли осуществиться окисление СН₃ - СН₂ - СН₂ - ОН 

СН₃ - СН₂ - СН = О в бескислородной среде? Какие условия для этого необходимы? Написать схему реакции.

2. Может ли и при каком условии в бескислородной среде произойти окисление по типу СН₃ - СН₂ - СН = О  СН₃ - СН₂ – СООН? Укажите необходимые компоненты, составьте схему реакции. Как пояснить появление двух атомов кислорода в продукте реакции.

3. Является ли кислород исключительным (единственным) конечным акцептором водорода в цепи тканевого дыхания и вообще в биологическом окислении?

4. Почему окисление в живой природе отождествляли с горением вне организма? Назовите внешние признаки сходства между горением и процессом окисления в организме. Назовите отличия между этими процессами.

5. Напишите реакции дегидрирования соединений:

R-СН₂ –СН₂ - R; R-СН=О; R- СНОН -R; R-СН=СН-R

6. Установите соответствие:

Редокс-потенциал: А.+0,82; Б. +0,10; В.+ 0,25; Г.- 0,22

Компонент ЦПЭ: 1.Убихинон; 2.Кислород; 3.ФМН; 4.Цитохром

7. Какие из перечисленных соединений являются субстратами ФАД-зависимой дегидрогеназы : глюкоза, сахароза; янтарная кислота; глицериновый альдегид, НАДН ⁺.

8. Напишите схему переноса электронов и протонов от изоцитрата на кислород (изоцитратдегидрогеназа – НАД-зависимый фермент) и укажите

название всех ферментных комплексов.

7. Лекарственные препараты – производные барбитуровой кислоты:

А. Оказывают снотворное действие.

Б. Активируют тканевое дыхание.

В. Ингибируют НАДН-дегидрогнназу.

Д. Вызывают гипоэнергетическое состояние.

Занятие 5. Окислительное фосфорилирование.

Цель: изучить механизмы транспорта протонов и электронов по дыхательной цепи во внутренней мембране митохондрий; окислительного фосфорилирование; механизм сопряжения с тканевым дыханием и разобщение.

Студент должен знать:

1. В какой роли выступает в процессе тканевого дыхания окисляемый субстрат. Природа субстрата

2. Ферменты тканевого дыхания, их структура, последовательность взаимодействия, локализация в клетке. Чем определяется направление транспорта электронов по дыхательной цепи (ЦПЭ).

4. Механизм окислительного фосфорилирования. Как энергия электронов трансформируется в макроэргические связи АТФ. Коэффициент сопряжения (Р/О).

5. Дыхательный контроль.

6. Транспорт АТФ и АДФ через мембраны митохондрий.

7. Разобщители. Механизм действия. Результат действия. Примеры. Значение в организме; в фармакологии.

8. Ингибиторы окислительного фосфорилирования.

Студент должен уметь:

1. Изобразить схематично сопряжение тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования.

2. Прогнозировать величину Р/О в условиях наличия всех компонентов дыхательной цепи; в присутствии ингибиторов ферментов дыхательной цепи или разобщителей.

Студент должен владеть: принципами планирования экспериментального исследования и анализа полученных результатов; информацией о патологических состояниях, ведущих к нарушению энергетического обмена.

Сведения из базовых дисциплин, необходимые для изучения темы:

1. основные положения термодинамики;

2. представления об окислительно-восстановительным потенциале;

2. понятие о сопряжение экзергонических и эндергонических процессов

Задания для самоподготовки:

Изучите материал темы в соответствии с целевыми вопросами («студент должен знать») и письменно выполните следующие задания:

1.Назовите процессы синтеза АТФ в организме. Перечислите компоненты,

необходимые для этих синтезов.

2. Дайте содержание понятия «Окислительное фосфорилирование»

3. Составьте схему последовательных этапов превращений энергии в клетке, приводящих к синтезу АТФ в процессе окислительного фосфорилирования. Как энергия электронов окисляемого вещества трансформируется в макроэргические связи АТФ?

4. В чем состоит роль тканевого дыхания в синтезе АТФ в процессе окислительного фосфорилирования. Какой процесс определяет создание градиента концентрации протонов и создание электрохимического потенциала на внутренней мембране митохондрии? В какой вид энергии трансформируется энергия электронов, переносимых по дыхательной цепи?

5. Что обеспечивает протонный электрохимический потенциал?

6. Что характеризует коэффициент Р/О.

7. Изобразите схематично сопряжение тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования.

8. Проверьте свои знания: Укажите правильный порядок этапов превращения энергии в организме человека при синтезе АТФ путем окислительного фосфорилирования:

А. Энергия химических связей веществ, поступающих с пищей.

Б. Энергия электронов в восстановленных коферментах НАДН и ФАДН.

В. Энергия электронов, проходящих через цитохромы дыхательной цепи.

Г. Энергия протонного электрохимического потенциала на внутренней мембране митохондрий.

Д. Энергия макроэргических связей АТФ.

9. Проверьте свои знания: Укажите правильный порядок этапов превращения в организме человека при синтезе АТФ путем окислительного фосфорилирования:

А. Дегидрирование окисляемого вещества.

Б. Образование промежуточного метаболита, способного окисляться.

В. Создание градиента концентрации протонов по обеим сторонам внутренней мембраны митохондрий.

Г. Перенос электронов по ферментам дыхательной цепи.

Д. Перенос протонов из матрикса митохондрии в межмембранное пространство.

Е. Создание протонного электрохимического потенциала.

Ж. Синтез АТФ.

З. Перенос протонов через внутреннюю мембрану в митохондриальный матрикс.

Сравните ответ с заданием № 3.

10. Как происходит транспорт образовавшейся АТФ в цитозоль

11. Все перечисленные Вами процессы тесно сопряжены и могут происходить и изменяться одновременно

12. Дайте содержание понятия «Дыхательный контроль».

13. Эффект разобщителей тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования.

14. Механизм разобщения тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования в буром жире ребенка. Значение этого процесса для организма

15. Составьте краткое резюме по теме «Биоэнергетика».