Аудиторная работа

Лабораторная работа:

1. Влияние температуры на каталитическую активность амилазы слюны. Амилаза слюны катализирует расщепление крахмала через стадию образования декстринов до дисахарида - мальтозы, которая обладает восстанавливающими свойствами. О действии фермента можно судить по исчезновению субстрата амилазы (крахмала) или по образованию конечных продуктов расщепления. Крахмал обнаруживается пробой Люголя (синее окрашивание со свободным иодом).

Об активности фермента можно судить также по обнаружению продуктов реакции. Мальтоза открывается реакцией Троммера ( при нагревании с восстанавливающим углеводом гидрат окиси меди восстанавливается сначала в гидрат закиси желтого цвета, затем – в закись меди кирпично-красного цвета).

Ход работы: В четыре пробирки отмерить по 4 мл 0,5%-ого раствора крахмала и по 1 мл слюны, предварительно разведенной в 10 раз водой. 1-ю пробирку (незамедлительно) поместить в кипящую водяную баню, 2-ю – в ледяную, 3-ю - в термостат при 37⁰ С, 4-ю оставить при комнатной температуре. Через 10мин содержимое каждой пробирки разделить на две примерно равные части.

С одной частью провести качественную пробу на крахмал, с другой – на восстанавливающий углевод (пробы Люголя и Троммера соответственно):

а. к содержимому одной пробирки добавить 2 капли раствора Люголя – появление синего окрашивания свидетельствует о наличии крахмала;

б. к содержимому второй пробирки добавить 1 мл 10% -ого раствора едкого калия и по каплям внести 1% -ный раствор сернокислой меди до образования неисчезающего осадка, затеи нагреть до кипения –появление желтого окрашивания, переходящее в кирпично-красное, указывает на наличие восстанавливающего углевода.

Сравнить результаты проб, проведенных при разных температурах и сделать выводы о температурном оптимуме амилазы. Построить график зависимости скорости реакции от температуры.

2. Влияние рН на активность амилазы слюны.

Зависимость активности ферментов от концентрации Н-ионов можно проследить в опытах с амилазой слюны, рН-оптимум которой равен 6,8.

Ход работы: В три пробирки внести по 3 мл буферного раствора с рН 1,2; 6,8; 10,0. Добавить в каждую пробирку по 1 мл слюны, разведенной водой в 10 раз, и по 2 мл 0,5%-ного раствора крахмала. Смешать и инкубировать при 37^о С 10мин. Подкислить содержимое второй и третьей пробирок добавлением соответственно 1 и 2 мл 0,1 н соляной кислоты ( реакция на крахмал положительна только в кислой среде) и провести пробу Люголя. Сравнить интенсивность распада крахмала зависимости от рН. Построить график зависимости скорости реакции от рН среды. Определить рН-оптимум амилазы слюны.

3. Специфичность действия ферментов. Специфическими субстратами амилазы слюны являются крахмал и гликоген, расщепление которых амилаза катализирует. Образующаяся при расщеплении крахмала мальтоза обнаруживается пробой Троммера.

Используя в качестве субстрата сахарозу, можно убедиться в том, что амилаза не катализирует распад сахарозы.

Ход работы: В одну пробирку внести 2 мл 0,5%-ого раствора крахмала, в другую – 2 мл 2%-ного раствора сахарозы. Добавить в обе пробирки по 2 мл слюны, разведенной в 10 раз водой, смешать и оставить на 10 мин при 37^о С.

Провести с содержимым обеих пробирок пробу Троммера. Она окажется положительной при наличии редуцирующего углевода – мальтозы (пробирка первая) и отрицательной в присутствии редуцирующего углевода (пробирка вторая).

Дайте обоснованные ответы на следующее:

1.Какой из предложенных ниже способов можно использовать для определения активности амилазы слюны:

а. по определению остаточной концентрации крахмала;

б. по нарастанию количества мальтозы;

в. по изменению рН среды в ходе реакции.

2. Скорость взаимодействия А+Б увеличилась после добавления вещества К в три раза. В качестве конечных продуктов обнаруживаются соединения АК и БК. Является ли вещество К катализатором?

3.Построить график зависимости V от S по экспериментальным данным: S - 1, 2, 4,6,10,15,17,18,22 мМоль/л; соответственно V равна: 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 1,0; 1,5; 1,6; 1,6; 1,6

Определить с помощью графика константу Михаэлиса. Как по константе Михаэлиса судят о степени сродства энзима к субстрату?

4. Фермент катализирует реакцию расщепления пептидных связей в молекуле белка. Назовите класс и подкласс фермента. Изобразите схему реакции на конкретном примере.

5. Фермент катализирует отщепление карбоксильной группы в виде СО₂ от молекулы аминокислоты. Назовите класс и подкласс фермента. Изобразите схему реакции на конкретном примере.

6. Фермент катализирует перенос аминогруппы от аминокислоты на кетокислоту. Назовите класс и подкласс фермента. Изобразите схему реакции на конкретном примере.

7. Фермент катализирует превращение молекулы глюкозы в молекулу фруктозы. Назовите класс фермента. Изобразите схему реакции на конкретном примере.

8. При определении активности фермента получены данные, представленные в таблице:

рН	1,0	1,2	1,5	2,0	3,0	4,0	5,0	6,0	7,0	8,0
активность,ед	12	18	25	38	31	27	21	17	11	2,0

Построить график зависимости активности фермента от рН, высказать предположение о том, какой фермент находится в растворе, определить принадлежность фермента к классу и группе соответственно высказанному предположению.

9. Субстрат исследуемого фермента образует белый осадок при нагревании, дает положительную биуретовую реакцию. После длительной инкубации с ферментом при разных значениях рН интенсивность биуретовой реакции снизилась, увеличилось число свободных аминогрупп, усилилась положительная реакция с нингидрином. Особенно заметными эти изменения были при рН 8,0-8,5.

Назовите субстрат, фермент, определите принадлежность фермента к классу и группе. Почему увеличилось число свободных аминогрупп?

Сравните Ваши ответы с эталонными ответами и рассчитайте % правильных ответов. Выявите с помощью лекций и учебника причину Ваших ошибок.

Занятие 3. Регуляция активности ферментов. Эффекторы ферментов.

Цель: изучить механизмы регуляции активности ферментов; действия активаторов и ингибиторов ферментов, их классификацию и номенклатуру. Ознакомиться с одним из количественных методов определения активности фермента.

Студент должен знать:

1. Механизмы (способы, типы) регуляции активности ферментов

2. Классификация ферментативных эффекторов, их разделение на подгруппы в зависимости от механизма действия; их механизмы действия (обратимы и необратимые ингибиторы; конкурентные и неконкурентные ингибиторы, примеры, значение).

3. Особенности строения, функционирования и локализации аллостерических ферментов.

4. Особенности и биологическое значение аллостерических эффекторов. Аллостерическая регуляция.

5. Понятие об изоферментах.

6. Понятие об энзимопатиях.

7.Понятие об энзимодиагностике. Причины, приводящие к увеличению количества ферментов в крови.

8.Понятие «профермент» и механизмы превращения проферментов в фермент.

9. Принципы определения активности фермента.

10. Принципы обнаружения в биологической жидкости активатора или ингибитора.

Студент должен уметь:

1. Строить график зависимости скорости реакции от концентрации субстрата в присутствии конкурентного и неконкурентного ингибитора. Оценить кинетические параметры: Vмах и Км.

2. Строить график зависимости скорости реакции, катализируемой аллостерическим ферментом, от концентрации субстрата.

Студент должен владеть: принципами планирования исследований активности ферментов и интерпретации полученных результатов.

О заболеваниях, вызванных появлением в избытке физиологических ингибиторов ферментов;

Об использовании эффекторов ферментов в медицине (эффекторы как фармпрепараты).

Задания для самоподготовки:

Изучите материал темы в соответствии с целевыми вопросами («студент должен знать») и письменно выполните следующие задания:

Запомните, что скорость ферментативной реакции зависит от количества субстрата, количества фермента или от его активности. Изменение активности фермента связано с изменением конформации белковой молекулы фермента и его активного центра.

Механизмы регуляции активности ферментов: частичный протеолиз; фосфорилирование и дефосфорилирование,

ассоциация и диссоциация, аллостерическая.

1. Дайте определение понятия «Ферментативные эффекторы». Виды эффекторов.

2. Проверьте свои знания: Перепишите фразу, убрав лишнее: «обратимые ингибиторы – это соединения, которые ковалентно нековалентно связываются с субстратом ферментом и не могут могут диссоциировать от фермента субстрата.

2. В чем состоит основная особенность конкурентных ингибиторов?

3. Какие ингибиторы называют антиметаболитами?

4. Покажите с помощью символов ( Е-фермент, S – субстрат, I-ингибитор) как протекает реакция Е+ S в присутствии конкурентного ингибитора.

6. Изобразите графически зависимость скорости реакции от концентрации субстрата без ингибитора и в присутствии конкурентного ингибитора в концентрациях 1 и 2 мМоль/л. Укажите на графике значение Км. Дайте биологическую интерпретацию значению Км.

7. Проверьте свои знания: Конкурентные ингибиторы ферментов изменяют:

А. Vмах; Б. Км ; В. Vмах и Км; Г. Специфичность к субстрату

7. В чем состоит основная особенность неконкурентных ингибиторов?

Покажите с помощью символов ( Е-фермент, S – субстрат, I-ингибитор) как протекает реакция Е+ S в присутствии неконкурентного ингибитора

9. Изобразите графически зависимость скорости реакции от концентрации субстрата без ингибитора и в присутствии неконкурентного ингибитора в концентрациях 1 и 2 мМоль/л. Укажите на графике значение Км. Дайте биологическую интерпретацию значению Км.

10. Проверьте свои знания: Неконкурентные ингибиторы ферментов изменяют:

А. Vмах; Б. Км ; В. Vмах и Км; Г. Специфичность к субстрату

11. Укажите локализацию регуляторного (ключевого) фермента в метаболическом пути. Роль регуляторных ферментов в метаболизме клетки.

10. Назовите способы регуляции активности ферментов в клетке. Охарактеризуйте их принципы.

13. Особенности строения и функционирования аллостерических ферментов.

14. Проверьте свои знания: Регулировать активность ферментов можно (выберите один наиболее общий ответ):

а. с помощью аллостерического эффектора;

б. путем фосфорилирования и дефосфорилирования;

в. ограниченным протеолизом;

г. изменив конформацию активного центра

15. Для каких ферментов характерен кооперативный эффект, в чем он состоит?

16. Перечислите соединения, являющиеся активаторами ферментов и покажите механизм их действия.

17. Дайте понятия энзимодиагностика, энзимопатия, энзимодиагностика.

18. Составьте краткое резюме по теме «Ферменты»