Аудиторная работа

Лабораторная работа

1. Высаливание белков сыворотки крови сульфатом аммония может использоваться для разделения альбуминов и глобулинов, так как глобулины осаждаются при 50%-ном насыщении сульфатом аммония, а альбумины – при 100%-ном насыщении.

Ход работы: В пробирку внести 2 мл сыворотки крови и прибавить столько же насыщенного раствора сульфата аммония. Образующийся осадок отфильтровать – на фильтре при этом останутся глобулины. К фильтрату добавить сухого тонко измельченного порошка сульфата аммония до насыщения. Образующийся при этом осадок, представленный альбуминами, отделить фильтрованием.

Высаливание сульфатом аммония обратимо. В этом можно убедиться, поместив фильтры с осадком белка в воду – происходит растворение осадка.

В протоколе укажите принцип метода высаливания

Лабораторная работа:

Анализ гидролизата нуклеопротеидов.

Ход работы: Гидролиз: в круглодонную колбу поместить 1 грамм дрожжей, добавить 20 мл 10%-ого раствора серной кислоты и столько же дистиллированной воды. Колбу закрыть пробкой с обратным холодильником и кипятить под тягой 1,5 ч при слабом нагревании. Жидкость охладить, довести водой до исходного объема, фильтровать. Фильтрат использовать для следующих качественных реакций:

а) биуретовая реакция (для обнаружения полипептидов). К 5 каплям полученного гидролизата прибавить 10 капель 10%-ого раствора едкого натрия и 1 каплю 1% -ого раствора сернокислой меди. Жидкость окрашивается в розовый цвет.

б) серебряная проба (для обнаружения пуриновых оснований). К 5 каплям гидролизата прилить 5 капель 2 %-ого аммиачного раствора азотнокислого серебра. Через 3-5 мин выпадает небольшой бурый осадок серебряных соединений пуриновых оснований.

в) качественная реакция Молиша (для обнаружения пентозной группировки). К 10 каплям гидролизата прилить 2-3 капли 1%-ого раствора тимола в этаноле, перемешать и по стенке пробирки опустить равный объем концентрированной серной кислоты (осторожно!!!) – появляется отчетливое красное кольцо.

г) молибденовая проба (для обнаружения фосфорной кислоты). К 5 каплям гидролизата прилить 5 капель молибденового реактива и кипятить несколько минут. Появляется лимонно-желтое окрашивание, а при охлаждении – желтый кристаллический осадок комплексного соединения фосфорномолибденовокислого аммония.

В протоколе укажите степень гидролиза нуклеопротеида.

Дайте письменные обоснованные ответы:

1. Как узнать, осажден ли полностью белок из биологической жидкости после 50% насыщения ее сульфатом аммония?

Дополнительные сведения: жидкость после 50% насыщения сульфатом аммония и фильтрования прозрачна.

2. Как используя биуретовый метод определения белка и сульфат аммония, установить соотношение между альбуминами и глобулинами сыворотки крови?

3. Раствор белка кипятили 1,5 часа в присутствии серной кислоты. Будет ли биуретовая реакция на продукты положительной? Ответ аргументировать.

4. Запишите формулу пептида: ала-глу-асп-лиз-мет.

а. Определите суммарный заряд пептида при рН 7,0;

Как суммарный заряд влияет на растворимость?

б. в какой среде лежит ИЭТ данного пептида;

в. при каком значении рН будет наблюдаться наименьшая растворимость данного пептида?

5. Почему кислое молоко в отличие от свежего сворачивается (т.е. белок молока казеин выпадает в осадок). В свежем молоке молекулы казеина имеют отрицательный заряд.

6. Почему протамины и гистоны коагулируют при нагревании в сильно щелочной среде?

7. Определите направление движения в электрическом поле двух пептидов при рН 7,0 ( при электрофорезе – к катоду или аноду):

а) вал- глу- ала б. лей-асп-арг

8. Подберите к методу разделения и очистки белков их соответствующие свойства, на которых основан данный метод:

Методы: Свойства:

1. Гель-фильтрация; . А..Различия по величине заряда

2. Электрофорез; Б. Различие по молекул. массе

3. Афинная хроматография; В. Оба

4.Ионнообменная хроматография Г. Ни одно из свойств

9. Денатурация белка сопровождается:

а. Разрывом ковалентных связей

б. Изменением пространственной конформации белка

в. Уменьшением растворимости белка

г. Нарушением связывания белка с лигандом

д. Нарушением первичной структуры белка

10. Белки денатурируют в клетке в результате:

а. Повышения температуры

б. Изменения рН

в. Действия протеолитических ферментов

г. Разрыва слабых связей, поддерживающих конформацию белка

д. Синтеза шаперонов

Сравните Ваши ответы с эталонными ответами и рассчитайте % правильных ответов. Выявите с помощью лекций и учебника причину Ваших ошибок.

Тема: Ферменты

Цель: изучить химическую природу, свойства и функции ферментов, классификацию, их механизм действия.

Значение темы:Обмен веществ, важнейшая особенность живых организмов, представляет собой совокупность химических реакций, главным образом, ферментативных.Обмен веществ был бы невозможенбез резкого ускорения реакций, на которых он основан, без согласования во времени и пространстве множества биохимических процессов,т.е. без участия ферментов. Ферменты (биологические катализаторы) имеют белковую природу, в связи с этим обладают особыми свойствами. Белковая природа ферментов обусловливает их высокую специфичность по отношению к субстратам и способность менять свою активность под действием различных факторов, что важно для регуляции метаболизма. Знания энзимологии (наука о ферментах) необходимы для понимания причин некоторых патологических состояний, понимания действия многих фармакологических препаратов; методы определения активности ферментов в биологических жидкостях используются в энзимодиагностике.

Занятие 2. Свойства ферментов. Основы кинетики ферментативного катализа.

Цель занятия: изучить свойства ферментов, обусловленные их белковой природой, их механизм действия и классификацию.

Студент должен знать:

1.Прямые и косвенные доказательства белковой природы ферментов.

2.Структурно-функциональная организация молекул ферментов.

3.Общие свойства ферментов как катализаторов.

4.Механизм действия ферментов (этапы ферментативной реакции).

5.Свойства ферментов, обусловленные их белковой природой.

6.Факторы, влияющие на скорость ферментативной реакции.

7.Характеристика кинетических параметров – максимальная скорость, константа Михаэлиса.

8.Единицы активности ферментов.

9.Принцип классификации, современная классификация и номенклатура ферментов.

Студент должен уметь:

1. Построить название фермента, исходя из характера субстрата и химического превращения.

2. Оценить графически результаты лабораторного определения рН-зависимости активности ферментов и зависимости от температуры. Определить температурный и рН-оптимум фермента.

4. Строить график зависимости скорости реакции от концентрации субстрата, определить константу Михаэлиса.

Студент должен владеть информацией о принципах графического анализа ферментативных реакций, существовании заболеваний, обусловленных дефектами генов, ответственных за синтез белков-ферментов;

О возможностях, которые предоставляет энзимология практической медицине.

Сведения из базовых дисциплин, необходимые для изучения темы:

1. Основные положения о катализе.

2. Сведения о связи структуры и функции.

Задания для самоподготовки:

Изучите материал темы в соответствии с целевыми вопросами («студент должен знать») и письменно выполните следующие задания:

1. Определить содержание понятий: «фермент», «активный центр», «кофактор», «кофермент», «апофермент». Назовите основные коферменты.

2. Объясните причину ускорения реакции в присутствии фермента

3. Проверьте свои знания: Активный центр фермента формируется на уровне: а. первичной структуры; б. вторичной структуры; в. третичной

4. Запишите этапы ферментативной реакции символами: E,S,P. Охарактеризуйте каждый этап. С образованием какого продукта связано снижение энергетического барьера (энергии активации).

5. Проверьте свои знания: В ходе ферментативного катализа при образовании фермент-субстратного комплекса:

а. Изменяется конформация субстрата

б. Образуются нековалентные связи между субстратом и ферментом

в. Сближаются функциональные группы, участвующие в катализе

г. Изменяется порядок соединения аминокислот в молекуле фермента

д. Усиливается комплементарность между ферментом и субстратами

6. Заполните таблицу: Свойства ферментов

Общие свойства ферментов как катализаторов	Свойства ферментов, обусловленные их белковой природой
1	1
2	2
3	3
	4

7. Проверьте свои знания: Выберите правильное утверждение:

а. катализатор ускоряет реакцию, но не участвует в ней

б. катализатор ускоряет реакцию, образуя промежуточные соединения с исходными продуктами, и входит в состав конечных продуктов;

в. катализатор ускоряет реакцию, взаимодействуя с реагирующими соединениями, но не входит в состав конечных продуктов;

8. Проверьте свои знания: Вещества А и Б взаимодействует по схеме А+ Б; АБ. При заданной концентрации А и Б через 30 мин после их смешивания устанавливается подвижное равновесие – скорость прямой и обратной реакции уравниваются.

Какие из приведенных характеристик изменит внесение катализатора ?

9. Что является предметом изучения в разделе энзимологии – ферментативной кинетике?

10. Перечислите факторы, влияющие на скорость ферментативных реакций. Постройте графики зависимостей скорости реакций от температуры, рН среды, концентрации фермента и субстрата. Объясните характер кривой. На графике зависимости VотSукажитеV_max ,K_m

11. Дайте содержание понятия «индуцируемая адаптация ферментов»

12. Проверьте свои знания: Характер зависимости скорости ферментативной реакции от температуры зависит от:

а. ионной силы раствора; б. ионизации функциональных групп фермента;

в. денатурации молекулы фермента; г. тепловой денатурации субстрата

13. Проверьте свои знания: Характер зависимости скорости ферментативной реакции от рН среды зависит от:

а. ионизациии функциональных групп фермента;

б. ионизации субстрата;

в. конформации фермента и его активного центра

14. Проверьте свои знания: Определите соответствие:

А. Константа Михаэлиса

Б. Максимальная скорость

В. Оба параметра

Г. Ни один из параметров

1. Параметр кинетики ферментативного катализа

2. Величина, при которой все молекулы фермента находятся в формеES

3. Чем больше величина, тем меньше сродство к субстрату

4. Концентрация субстрата при котором достигается насыщение

15. Активность фермента определяют по скорости ферментативной реакции. На чем основано определение скорости? 1…, 2….

16. Активность фермента выражают в единицах активности. Назовите эти величины.

17. На чем основана классификация ферментов?

18. Укажите класс и предположительно название ферментов следующих реакций:

а. разрыв связи –С-С-:

глютаминовая кислота щавелевоуксусная кислота + СО₂

б. образование новой молекулы с использованием АТФ:

пировиноградная кислота + СО₂ +АТФщавелевоуксусная кислота

в. разрыв связей с присоединением воды:

белок альфа-аминокислоты

г. перенос функциональных групп:

аланин + альфа-кетоглутаровая кислота пировиноградная кислота+ глютаминовая кислота

д. перенос группы внутри молекулы:

3-фосфоглицериновая кислота 2-фосфоглицериновая кислота

е. альдегид кислота