1.5. Определение интенсивности дыхания спермиев

(активность дегидрогеназы)

Материал и оборудование: свежеполученная сперма, 0,01%-ныйраствор метиленового синего, стеклянные капилляры, стеклянные палочки, глазные пипетки, лист белой бумаги, резиновая трубка, термостат.

Метод основывается на том, что в анаэробных условиях спермин используют для дыхания кислород из молекул метиленового синего, в результате чего раствор обесцвечивается. Поскольку дыхание происходит под влиянием дегидрогеназы, то по существу скорость обесцвечивания раствора метиленового синего показывает активность названного энзима.

Для определения на теплое (30-37⁰С) предметное стекло наносят каплю, спермы и каплю метиленового синего (30 ⁰С). Капли быстро перемешивают, и смесь набирают в два теплых стеклянных капилляра длина которых должна быть не менее 5-6 см и диаметр 0,8-1,0 мм. Длина столба в трубке должна быть примерно 2-3 см. В столбе смеси не должно быть пузырьков воздуха. Капилляры кладут горизонтально и помещают в термостат (+ 37 ⁰С) на белую бумагу. Регистрируют время (таблица 3), в течение которого обесцвечивается раствор метиленового синего.

Таблица 3 - Оценка качества спермы по времени обесцвечивания метиленовой сини (в минутах)

Качество спермы	Бык	Баран
Хорошее	5 – 10	3 – 7
Среднее	11 – 30	8 – 12
Плохое (непригодное для использования)	более 30	более 12

Результат является более объективным, если вычисляют и активность дегидрогеназы, поскольку с помощью этого показателя учитывается как подвижность спермиев, так и их концентрация.

Активность дегидрогеназы в условных единицах получают по формуле:

Да = (Пс×t×С)/10, где:

Да – активность дегидрогеназы;

Пс – подвижность спермиев в баллах;

t – время обесцвечивания раствора метиленового синего в минутах;

С – концентрация спермиев (млрд./мл).

Допустимая активность дегидрогеназы должна быть в сперме быка в пределах 16,8 у. е., для барана 9,6 у. е. пределах 16,8 у. е., для барана 9,6 у. е.

1.6. Определение абсолютной выживаемости спермиев

Материал и оборудование: сперма, микроскопы, обогревательные столики, сухие стерильные пробирки с пробками на 2 мл, стерильные мерные пипетки (1-2 см³), штатив, синтетический разбавитель, термос со льдом, стерильные стеклянные палочки, предметные и покровные стекла.

Под выживаемостью спермиев подразумевают продолжительность их жизни вне организма в определенных условиях. Это важный показатель качества спермы, поскольку он дает возможность предсказать оплодотворяющую способность спермы. Выживаемость спермиев выражается абсолютной выживаемостью (S).

Для определения абсолютного показателя выживаемости спермиев берут 11 стерильных пробирок емкостью по 2 мл и нумеруют восковым карандашом. Во все пробирки, за исключением первой, наливают по 0,5 мл синтетической среды. В первую и вторую пробирки вносят по 0,5 мл неразбавленной спермы. Первая пробирка в дальнейшем служит контролем.

Сперму во второй пробирке тщательно перемешивают со средой путем пипетирования и из нее переносят 0,5 мл в третью пробирку; в третьей пробирке смесь перемешивают и переносят в четвертую и т.д. Из последней пробирки (11-ой) 0,5 мл смеси выливают. Таким образом, в первой пробирке сперма не разбавленная, а в пробирках со 2 по 11-ую сперма разбавлена в 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512, 1024 раза.

Из каждой пробирки на теплое предметное стекло берут каплю, спер-мы и оценивают подвижность. Пробирки устанавливают в штатив, закрывают стерильными пробками и ставят на хранение в термос со льдом.

В последующем ежедневно оценивают подвижность спермиев под микроскопом при температуре 40 ⁰С. Оценку подвижности проводят до установления гибели всех спермиев во всех пробирках. Результаты исследований заносят в таблицу. Показатель абсолютной выживаемости (S) определяют по формуле:

S = а ₁t ₁ + а ₂t ₂ + a ₃t ₃+ ... a _nt _n

где: а ₁, а ₂, а ₃ , а_n – подвижность спермиев за интервалы времени, в балах;

t₁ , t ₂ , t ₃ , t_n – последовательные интервалы времени, в часах. Интервалы времени в часах определяются по формуле:

t = (Тn+1 - Т n-1)/2

где: Т – часы опыта,

Тn+1 - время в часах от начала опыта до последующего опреде-ления подвижности;

Т n-1 - время в часах от начала опыта до предыдущего определе-ния подвижности.

Хорошая сперма быка и барана, разбавленная синтетической средой в 16-32 раза, должна иметь показатель абсолютной выживаемости спермиев не ниже 1 400, хряка - 900, жеребца - 400 и выше.