1.3. Определение процентного отношения нормальных и патологических форм спермиев
Материал и оборудование: сперма, предметные стекла, фильтровальная бумага, пипетки, стеклянные палочки, дистиллированная вода, толстостенная стеклянная емкость, подставки, микроскоп, иммерсионное масло, 0,9% раствор натрия хлорида, емкость на 10 мл, 2% раствор эозина.
В каждом эякуляте могут содержаться деформированные спермии (патологические). Увеличение их количества выше допустимых пределов свидетельствует о патологических процессах в половых органах самца.
К числу патологических форм спермиев относят: гигантские и карликов-ые, с деформацией головки, с двумя головками, с надломом шейки, изолированные головки, с искривленным или закругленным хвостом, с двумя хвостами, утолщением хвоста и др.
Свежеполученную сперму с целью уменьшения концентрации спер-миев и удобства подсчета в мазке необходимо разбавить раствором натрия хлорида. Сперму барана разбавляют в 20-30 раз, сперму быка в 10-15 раз, сперму хряка и жеребца в 2-3 раза. На предметном стекле делают тонкий мазок спермы методом стекающей капли. Для чего на один конец предметного стекла пипеткой наносят каплю и дают ей стечь, удерживая стекло под углом 40-500. Приготовленный мазок высушивают на воздухе, а затем фиксируют. Для фиксации предметное стекло кладут горизонтально на специальную под-ставку и с помощью глазной пипетки на всю поверхность мазка наносят 960 спирт-ректификат. Через 1-2 минуты зафиксированный мазок ополаскивают дистиллированной водой и окрашивают. Окраску проводят 2%-ным раствором эозина. На мазок накладывают полоску фильтровальной бумаги, и глаз-ной пипеткой, обильно наносят раствор эозина. Через 4-5 минут полоску фильтровальной бумаги снимают, а краску смывают дистиллированной водой. Мазок высушивают на воздухе, предварительно удалив фильтровальной бумагой капли воды.
Исследование мазка проводят под увеличением 400-600 раз. Передвигая мазок, подсчитывают в каждом поле зрения все спермин. Учитывают от-дельно нормальные и патологические. Общее количество подсчитанных спермиев должно быть не менее 500.
Вычисляют процент патологических.
Пример: Всего подсчитано 500 спермиев, в том числе 50 патологических.
500 – 100%
50 – Х
Х = (50 * 100)/500 = 10%
Чем меньше в эякуляте производителя патологических спермиев, тем выше оплодотворяющая способность спермы. Максимальный допустимый процент спермиев в сперме: барана – 14%, быка – 18%, хряка и жеребца – 20%.
Рисунок 3 - Нормальные и патологические формы спермиев
1 – нормальные; 2 – гигантские и карликовые; 3 – с деформацией головки; 4 – с надломом шейки; 5 – бесхвостые и с укороченными хвостами; 6 – с деформацией хвоста; 7 – с цитоплазматической каплей и утолщением тела; 8 – двухвостые, двухголовые и прочие патологические формы.
1.4. Определение концентрации спермиев в сперме производителей
Определение концентрации спермиев в счетной камере.
Материал и оборудование: сперма, микроскопы, счетные камеры (с
сеткой Горяева), смесители (меланжеры) для эритроцитов и лейкоцитов, покровные стек-ла, 3%-ный раствор натрия хлорида, 96%--ный спирт, эфир, марлевые салфетки, ват-ные тампоны.
Концентрация спермиев в сперме — это степень насыщенности спермы сперматозоидами. Она выражается количеством спермиев в 1 мл в миллиардах.
Определение концентрации спермиев в сперме складывается из: раз-бавления спермы в смесителе; подготовки счетной камеры; зарядки счетной камеры; подсчета спермиев; вычисления концентрации исследуемой спермы.
Разбавление спермы в меланже. Для определения концентрации спермиев необходимо разбавить сперму в строго определенное количество раз. Для спермы быка и барана применяют эритроцитарный смеситель (с красным шариком), а для спермы хряка и жеребца - лейкоцитарный (с белым шариком) (рисунок 4).
В меланжер набирают сперму до метки 0,5, а затем 3-ный раствор натрия хлорида до верхней метки. Эту работу необходимо выполнить очень точно. Зажимают большим и указательным пальцами оба конца меланжера и встряхивают его в течение 2-3 минут до полного перемешивания спермы с раствором.
Подготовка счетной камеры. Счетная камера с сеткой Горяева — это
толстое предметное стекло, поверхность которого бороздками разделена на три части. На среднем, окруженном бороздками поле, находится счетная сет-ка, площадь которой равна 9 мм2. Это поле разделено на 225 больших квадратов, из них 25 в свою очередь разделены на 16 малых квадратиков. Пло-щадь каждого малого квадратика составляет 1/400 мм2.
Счетную камеру и покровное стекло протирают тампоном, смочен-ным в смеси спирта и эфира (поровну). Вытирают насухо марлевой салфеткой. Покрывают камеру покровным стеклом и притирают стекло к крайним пластинкам до появления радужных колец.
Зарядка счетной камеры. Из капилляра меланжера удаляют на сухой тампон первые 2-3 капли разбавленной спермы, 4-5-ую капли наносят на среднюю часть камеры у самого края притертого покровного стекла.
Подсчет спермиев. Камеру помещают на предметный столик микроскопа. Под малым увеличением находят сетку камеры, а затем переводят увеличение в 200-300 раз. Подсчет спермиев производят в 5-ти больших квадратах, которые разделены на маленькие. Считают в квадратах расположенных по диагонали или по углам и в центре. Считают головки спермиев, расположенные внутри маленьких квадратов, и на верхней и левой линиях.
Рисунок 4 - Смесители (меланжеры)
Вычисление концентрации спермиев. Концентрацию спермиев определяют по формуле:
С = (400 П.Д)/(N Р.1000000),
где: С - концентрация спермиев;
П — число подсчитанных спермиев;
Д — степень разбавления;
N - число сосчитанных малых квадратов (80);
Р - глубина камеры (О, 1 мм); 400 - множитель, введен в формулу для пересчета в 1 мм, так как площадь малого квадрата равна 1/400 мм2.
Для точности определения концентрации спермиев рекомендуется заправлять обе сетки и при подсчете брать средний показатель. Расхождение результатов не должно превышать 10%. Если разница больше 10%, подсчет повторяют третий раз и берут среднее из двух подсчетов, расходящихся не более чем на 10%.
Определение концентрации спермиев на фотоэлектроколориметре
ФЭК-М.
Материал и оборудование: сперма, фотоэлектроколориметр, 3,5%-ный раствор натрия цитрата, микропипетки (0,1 см3), мерные пипетки (10 см3), сухие чистые флаконы или пробирки, марлевые салфетки, фильтровальная бумага, смесь этилового спирта и эфира (поровну), дистиллированная вода, чашка толстостенная емкостью 0,5 литра.
Метод определения концентрации спермиев при помощи ФЭК-М основан на способности спермы ослаблять пропускаемый через нее пучок света пропорционально концентрации спермиев, то есть чем выше концентрация спермиев, тем больше ослабляется проходящий пучок света. Величина ослабления светового пучка регистрируется чувствительными фотоэлементами.
Определение концентрации на ФЭК-М начинают спустя 15-20 минут после включения лампы и засветки фотоэлементов. Для повышения точности исследований рукояткой устанавливают красные светофильтры. Левый отсче-тный барабан рукояткой выставляют на «О» по красной шкале (шкала оп-тической плотности).
Во флакон наливают 10 мл 3,5%-ного раствора натрия лимоннокисло-го вносят в него 0,1 мл спермы быка (сперма разбавляется в соотношении 1:100). Сперму барана разбавляют в соотношении 1: 400, то есть берут 10 мл 3,5%-ного раствора натрия лимоннокислого и 0,025 мл спермы. Сперму хряка -разбавляют в соотношении 1: 30, то есть к 12 мл 3,5%-ного раствора на-трия лимоннокислого добавляют 0,4 мл спермы, которая предварительно должна быть профильтрована через 2 слоя капроновой ткани для отделения студенистого секрета.
Пробы спермы отбирают микропипеткой емкостью 0,1-0,5 мл из се-редины свежеполученного эякулята. Перед внесением пробы спермы в раство-р микропипетку необходимо снаружи вытереть чистой марлевой салфет-ки. После внесения спермы в раствор микропипетку надо 2-3 раза прополоть в этом же растворе путем насасывания и выдувания.
Температура 3,5%-ного раствора натрия лимоннокислого должна быть в пределах 18-25 С.
После разбавления сперму тщательно перемешивают и наливают в кювету с рабочей длиной 10 мл до метки и быстро определяют оптическую плотность. Для этого на путь прохождения пучка света ставят в левый кюве-тодержатель чистую кювету с рабочей длиной 10 мм, наполненную 3,5%-ч раствором натрия лимоннокислого, а в правый кюветодержатель - 2 такие-к же кюветы: одну с разбавленной спермой, другую с 3,5%-ным раствором натрия лимоннокислого. При этом кювету с разбавленной спермой устанавливают на пути прохождения пучка света (как и в левом кюветодержателе), а кювету с раствором в запасное гнездо этого же кюветодержателя. Кюветы необходимо устанавливать перпендикулярно к пучку света.
Закрывают крышку прибора и включают гальванометр рукояткой сначала на грубую чувствительность в положение «1». Рукояткой нейтральных -клиньев подводят стрелку гальванометра к «0», затем включают гальванометр на высокую чувствительность, в положение «2» и точно устанавливают стрелку на «О». Затем гальванометр сразу же переводят на грубую чувствительность в положение «1». Меняют в правом кюветодержателе местами кюветы так, чтобы на пути прохождения света стала кювета с 3,5%-ным раствором натрия лимоннокислого. Это достигается путем поворота кюветодер-еля вокруг оси.
Опустив крышку прибора, опять включают гальванометр сначала на грубую чувствительность (не трогая ручку нейтральных клиньев) рукояткой барабана подводят отклонившуюся стрелку гальванометра на «О». Включают гальванометр на высокую чувствительность, точно устанавливают стрелку на «0», Рукоятку гальванометра переводят в положение «0».
Отсчет берут по красной шкале левого барабана и смотрят, какой величине концентрации он соответствует на калибровочной кривой, которую выводят заранее.
Построение калибровочной кривой. Для определения концентрации спермиев на ФЭК-М необходимо предварительно построить калибровочную кривую, изображающую зависимость оптической плотности от концентрации змиев.
Для построения калибровочной кривой из свежевзятых эякулятов выбир-ают несколько таких, в которых концентрация спермиев наиболее высокая. Тщательно определяют концентрацию спермиев в счетной камере.
Из отобранных эякулятов путем разбавления их 3,5%-ным раствором лимоннокислого натрия 1: 1, 1: 2, 1: 3 и т.д. готовят ряд образцов спермы и определяют концентрацию спермиев в каждом из них в счетной камере.
Определяют величину оптической плотности каждого образца на приборе, как описано в предыдущей методике. Зная фактическую концентрацию спермиев, установленную в счетной камере, строят калибровочную кривую. Для этого на миллиметровой бумаге откладывают: по горизонтальной оси – известные концентрации спермиев каждого образца, по вертикальной- оси – соответствующие им величины оптической плотности. В местах пересечения перпендикуляров ставят точки, калибровочную кривую проводят так, чтобы она прошла через большинство указанных точек, а число точек, лежащих выше или ниже калибровочной кривой, было примерно одинаковым.
Кривая не должна быть сильно изогнутой или изломанной.
Имея калибровочную кривую, можно легко определить неизвестную концентрацию спермиев любого эякулята. Для этого нужно лишь установить его оптическую плотность на приборе, как указано выше и посмотреть какой причине концентрации она соответствует на калибровочной кривой. При этом следует строго соблюдать все условия исследования, при которых выведена и калибровочная кривая. Надо применять ту же кратность разбавления спермы, использовать кюветы той же рабочей длины, те же светофильтры и тот же способ отсчета величин оптической плотности.
Калибровочную кривую следует ежемесячно проверять, так как пока-зания прибора могут изменяться.
Точность электрофотометрического метода определения концентрации спермиев и источник ошибок. По точности электрофотометрический метода определения концентрации спермиев почти не уступает методу опреде-ления в счетных камерах. Величина ошибки колеблется в пределах 6%.
Эта величина ошибки обусловлена в основном влиянием плазмы спермы к неточностью взятия проб. Влияние пигментации плазмы на точ-ность результатов исследования ослабляется применением красных монохр-оматических светофильтров.
Электрофотометрический метод определения концентрации спермиев требует исключительной аккуратности в работе.
Основными источниками ошибок могут быть:
1. Грязные кюветы, флаконы, микропипетки и другие предметы, которые имели контакт со спермой во время ее подготовки к исследованию;
2. Неточность взятия проб спермы микропипетками;
3. Неточность в разбавлении спермы перед исследованием;
4. Всевозможные механические примеси в 3,5%-ном растворе натрия лимоннокислого;
5. Загрязнение оптики прибора в результате неаккуратной работы;
6. Несвоевременность исследования проб спермы, что может привести к их подсыханию или биологическому загрязнению (развитию микрофлоры).
Для получения точных результатов не следует допускать перечисленных недостатков в исследовании. Кювету со спермой после каждого исследован-ия необходимо прополаскивать дистиллированной водой не менее 3 раз. Остатки воды в кювете убирают промокательной бумагой, а для исследования -очередного образца спермы берут другую кювету такой же рабочей длины.
Кювету берут только за боковые грани, чтобы не загрязнять рабочие поверхности.
После окончания работы все кюветы тщательно моют дистиллирован-ной водой. Несмываемые водой загрязнения устраняют смесью спирта с ром. Для этого используют марлевый тампон, намотанный на деревянную палочку.
Определение концентрации спермиев хряка при помощи оптического стандарта
Материалы и оборудование: сперма, оптический стандарт, пробирка (диаметр должен соответствовать диаметру оптического стандарта), 1%-ный раствор натрия хлорида, микропипетка (0, 1 см3), салфетки, мерная пипетка (5,0 см3), лист с печатным текстом.
В пустую пробирку вносят 1,0 мл 1%-ного раствора натрия хлорида. Микропипеткой набирают 0,1 мл свежеполученной профильтрованной спер-мы. Конец пипетки вытирают снаружи салфеткой, а затем два раза промыва-ют ее раствором в пробирке. Пробирку слегка встряхивают и держат рядом со стандартом. Стандарт предварительно должен быть хорошо взболтан. К пробиркам сзади вплотную прикладывают лист с печатным текстом.
К исследуемой сперме добавляют пипеткой 1%-ный раствор натрия хлорида в таком количестве, чтобы высота букв шрифта и оптическая плотность были одинаковы со стандартом. Каждый раз при добавлении раствора содержимое пробирки и стандарт встряхивают для получения равномерной взвеси.
После того как оптическая плотность исследуемой спермы и стандар-та совпадут, проводят расчет по формуле:
К = 50 (n + 0,1),
где: К – концентрация спермы (млн./мл);
n – объем внесенного 1%-ного раствора натрия хлорида (мл);
50 – коэффициент.
Оптический стандарт соответствует оптической плотности спермы хряков с концентрацией спермиев 5 млн./мл.
Пример: Для выравнивания оптической плотности до стандарта к ис-следуемой сперме добавлено всего 4,5 мл 1%-ного раствора натрия хлорида (с учетом ранее налитого в пустую пробирку).
К = 50 х (4,5 + 0,1) = 50 х 4,6 = 230 (млн./мл)
Следовательно, в 1 мл исследуемой спермы содержится 230 млн. спермиев.
Определение концентрации спермиев жеребца по стандартам
Материал и оборудование: сперма, стандарты.
Стандарты представляют собой стеклянные запаянные пробирки одинакового диаметра, с жидкостью имитирующей сперму жеребца разной концентрации: 10 - 20 - 200 - 300 и 500 млн. спермиев в 1 мл.
Сперму наливают в прилагаемую пустую пробирку такого же диаметра, и сравнивают со стандартом. Стандарты, предварительно встряхивают, чтобы осадок равномерно размешался. Пробирки просматривают на свет, при этом подбирают стандарт, наиболее близкий по густоте к определяемой сперме, который и принимают за ее концентрацию. Концентрация спермиев может быть определена и как промежуточная между двумя стандартами.
При концентрации более 500 млн. спермиев в 1 мл сперму можно разбавлять 7%-ным раствором глюкозы в 2 раза (1: 1), затем установить концен-трацию по стандартам и сделать соответствующий пересчет на неразбавлен-ную сперму.
Для большей точности определения к сравниваемым пробиркам сзади вплотную прикладывают стеклянную палочку.