БХ - 4 семестр / Разное / Б

Образование сплайсом

Сплайсинг РНК катализируется комплексами белков с РНК, известными как «малые ядерные рибонуклеопротеидные частицы»

Интроны, входящие в гяРНК (hnRNA), имеют специфические последовательности на 3'- и 5'- концах

151

На первой стадии сплайсинга ОНгруппа аденозилового остатка, расположенного в интроне, атакует (при участии мяРНП) и расщепляет фосфодиэфирную связь на 5'-конце интрона.

Одновременно в интроне образуется новая связь, которая придает ему

форму петли.

На второй стадии терминальная ОНгруппа 5'-концевого интрона атакует связь в 3'-конце интрона.

В результате оба экзона соединяются, а интрон освобождается.

В этой реакции принимают участие пять различных мяРНП (U1, U2, U4, U5 и U6). В каждой из реакций задействованы несколько белковых молекул и одна молекула мяРНК

(snRNA).

152

Во время сплайсинга комплексы из гяРНК и мяРНП образуют сплайсому. Полагают, что мяРНК в сплайсоме образуют канонические пары друг с другом и с гяРНК и таким образом фиксируют и ориентируют их реакционные группы. Собственно катализ обусловлен РНКсоставляющей сплайсомы Такие каталитические РНК носят название рибозимов.

В генной инженерии часто требуется выделить отдельный, пока еще не охарактеризованный фрагмент ДНК (DNA), например, с целью определения его полной нуклеотидной последовательности. Такая задача решается путем создании библиотек кДНК. Библиотека ДНК состоит из большого количества векторных молекул ДНК, содержащих различные фрагменты чужеродной ДНК.

153

Например, возможно получить все молекулы мРНК клетки в виде фрагментов ДНК - кДНК (англ. complementary DNA, cDNA) — и

произвольно внедрить эти копии в векторные молекулы.

Библиотека генов может быть получена путем расщепления ДНК клетки на небольшие фрагменты рестриктазами и последующего встраивания этих фрагментов в векторную ДНК.

154

В качестве векторов для получения библиотек ДНК используются бактериофаги (сокращенно: фаги). Фаги — это вирусы, которые инфицируют бактерии, где их геном реплицируется вместе с бактериальным геномом.

Библиотеки генов удобны тем, что в них легко вести поиск необходимых в данный момент фрагментов.

155

Работу начинают с того, что небольшую порцию ДНК, составляющую библиотеку (105- 106 фагов), разбавляют, смешивая с клетками бактерии-хозяина, и помещают на питательную среду.

Бактерии определенное время растут, образуя

на питательной среде плотный мутный слой клеток.

При этом бактерии, зараженные фагом, растут медленнее, чем неинфицированные клетки. Это приводит к образованию прозрачных кольцевых зон, «бляшек».

156

Клетки в «бляшке» содержат потомство фагов из первоначальной библиотеки. Образовавшиеся колонии переносят на нитроцеллюлозные или нейлоновые фильтры, накладывая их на поверхность слоя в чашке, и слегка подогревают.

Если теперь инкубировать фильтр с меченым

олигонуклеотидным зондом,

соответствующим нуклеотидной последовательности целевого фрагмента, произойдет гибридизация зонда с гомологичной последовательностью ДНК.

Место связывания зонда можно определить по радиоактивной или иной метке. После этого выделяют фаг из положительных (несущих метку) бляшек и размножают обычным образом.

Большие количества необходимого фрагмента получают с помощью расщепления ДНК рестриктазами.

157

158

159

Спасибо за внимание!

Биосинтез белка, регуляция. Патология обмена белков. (Белки-5)

Лекция 21

к.б.н., доцент Свергун В.Т.

доцент кафедры биохимии ГомГМУ

160