27) Применение ферментов в лабораторной диагностике

Медицинская энзимология - раздел клинической биохимии, который занимается изучением роли ферментов в заболеваниях, использование ферментов как лечебных препаратов и для диагностики.

Имеет 5 направлений:

1. Энзимопатология. (Изучение роли ферментов в развитие патологических процессов). Объект - изучения энзимопатиия.

2. Энзимодиагностика. (Изучение способов диагностики заболеваний путем определения активности ферментов).

3. Энзимотерапия. (Использование ферментов в качестве леарственных препаратов).

4. Инженерная энзимология. ( Использование ферментов в качестве технических и фармацевтических средств, в качестве реагентов).

5. Лабораторная диагностика. (Выделение ферментов в малых количествах).

28)Количественное определение каталазы

Количественное определение каталазы по Баху и Зубковой.

ПРИНЦИП МЕТОДА: основан на титриметрическом определении количества перекиси водорода, разложенной ферментом за определенный промежуток времени, по следующему уравнению:

2KMnO₄ + 5H₂O₂ + 4H₂SO₄  2KHSO₄ + 2MnSO₄ + 8H₂O + 5O₂

О количестве расщепленной перекиси водорода судят по разности количества KMnO₄, израсходованного на титрование до и после действия каталазы.

Активность каталазы выражают с помощью каталазного числа и показателя каталазы. Каталазным числом называют количество мг перекиси водорода, которое разлагается в 1 мкл крови

Клинико-диагностическое значение

Определение активности каталазы крови имеет значение для диагностики рака, анемии, туберкулеза. При этих заболеваниях активность каталазы в крови снижается.

ПРИМЕЧАНИЕ: Показателем каталазы служит дробь, в которой числителем является каталазное число, а знаменателем - число миллионов эритроцитов в 1 мкл исследуемой крови.

29)Определение амилазы мочи по Вольгемуту

ПРИНЦИП МЕТОДА: Определение активности амилазы в биологических жидкостях (моча, ликвор, слюна, сыворотка крови) основано на определении минимальной активности (количества) фермента, катализирующего в стандартных условиях гидролиз добавленного крахмала. Амилазная активность мочи выражается количеством мл крахмала, которое расщепляется ферментом, содержащимся в 1 мл неразведенной мочи, при температуре 45ºC за 15 минут.

Клинико-диагностическое значение.

Определение активности амилазы мочи и сыворотки крови широко используется в клинической практике для диагностики заболеваний поджелудочной железы. При острых панкреатитах амилазная активность мочи и сыворотки крови увеличивается в десятки раз, особенно в первые сутки заболевания, а затем постепенно возвращается к норме. При почечной недостаточности амилаза в моче отсутствует. В детском возрасте увеличение активности амилазы наблюдается при эндемическом паротите, что указывает на одновременное поражение поджелудочной железы вирусом паротита.

30)История учения о биологическом окислении

В XVII - XVIII вв широкое признание получила теория горючего начала - флогистона, сформулированная Штаммом. Эта теория объясняла процессы горения выделениями их горящего тела особого невесомого в-ва, и была опровергнута Ломоносовым и Лавуазье, которые открыли закон сохранения энергии.

В середине XVIII века было установлено:

1) процесс горения идет в воздушной среде с высокой температурой, дыхание - в среде с пониженной температурой;

2) при дыхании, как и при горении выделяется тепло, но в незначительных количествах;

3) конечные продукты CO₂ и H₂O.

В 1751 году Ломоносов подробно рассмотрел процессы горения и окисления.

В 1774 году Лавуазье повторил опыты Ломоосова и показал, что процессы горения и дыхания идентичны, т. к. образуются идентичные продукты.

Лавуазье назвал дыхание медленным горением и показал процесс сгорания Гл в организме:

C₆H₁₂O₆ + 6O₂ ------> 6CO₂ + 6H₂O + Q

В начале XIX века стали известными катализаторы, с помощью которых осуществлялись процессы окисления. Это были металлы, обладающие «внутренней силой».

В середине XIX века немецкий ученый Шейнбайн, открывший озон, предположил, что в организме образуется озон и он используется в реакциях окисления.

После работ Лавуазье в науке господствовало мнение о тождестве горения и медленного окисления питательных вкществ в организме. Вместе с тем было ясно, что БО протекает в необычных условиях:

- при пониженной температуре;

- без пламени;

- и в присутсвии большого количества H₂O (75% - 80% ткани).

В XIX веке появилось понятие о ферментах и причину своеобразного течения БО попытались объяснить «активацией» кислорода в клетках организма.

Одна из теорий была выдвинута Бахом, который считал, что «активация» молекулярного кислорода происходит в результате разрыва связи и присоединения к ферментам оксигеназам (А), способным к аутооксидации:

O A + O₂ -----> A |

O перекись

O

A | + SH₂ -----> S + A + H₂O₂ O субстарат

3 положения Баха:

1. Наличие высокоактивной оксидазы, но это не было обнаружено.

2.В тканях должна быть высокая концентрация H₂O₂, но это тоже не было обнаружено.

3. Высокая активность ферментов, разлагающих H₂O_2; это было обнаружено, существует 2 фермента:

каталаза

2H₂O₂ ------------> 2H₂O + O₂

Существует и другой механизм разложения H₂O₂:

2GSH + H₂O₂ -----> 2H₂O (пероксидаза) или глутатион |

SH₂ + H₂O₂ -----> S + 2H₂O ---

Эта теория да и все остальные основывались на неправильном представлении об ОВР. Окислительный процесс рассматривался как процесс взаимодействия любого вещества с кислородом. То есть кислород - это окислитеоь.

К концу XIX века с разхвитием физики ядра и накопления знаний о структуре вещества, было установлено, что не все процессы окисления требуют для своей реализации наличие кислорода.

Кроме этого теория Баха основывалась на том, что в организме имеется большое количество ароматических соединений, на самом же деле их очень мало, в оновном глюкоза.

Согласно современных представлений ОВР - это процесс перемещения электронов и протонов от донора (восстановителя) - это процесс окисления - к акцептору (окислителю) - процесс восстановления.

Количественной мерой ОВР является величина ОВП. В начале точки отсчета стандартного потенциала взят ОВП водорода.

В 1912 году была сформулирована теория Палладина-Виланда, согласно которой в организме есть промежуточные вещества, способные акцептировать электроны и протоны от субстрата с последующей передачей электронов и протонов на кислород, по этой теории весь процесс БО можно разбить на 2 этапа:

1) анаэробный - передача электронов и протонов с субстрата на промежуточное вещество;

2) аэробный - передача электронов и протонов с промежуточного вещества на кислород.

Палладин предпологал, что существует несколько промежуточных переносчиков, позволяющих организму поэтапно освобождать химическую энергию и кислород выступает в качестве конечного акцептора электронов и протонов.

1 анаэробный этап:

SH₂ + ----> S +

2 аэробный этап:

½ O_{2 -----> +} H₂O

Роль промежуточных переносчиков (хромогенов) выполняют коферменты (НАД; НАДФ; ФАД; ФМН) оксидоредуктаз.