Ферменты-токсины

Гемолизины - ферменты расщепления фосфолипидной мембраны эритроцитов. Они выявляются посевом культуры на кровяной агар (5-10%). Различают 7 b 0-гемолиз или полный гемолиз, когда образуются зоны просветления вокруг колоний,  7a 0-гемолиз, неполный гемолиз, при наличии зон зеленого цвета вокруг колоний. Отсутствие гемолиза обозначается как 7 g 0-гемолиз.

Цитотоксины- ферменты оказывающие токсический эффект на клетки мишени. Цитотоксичность токсина В анаэробных микроорганизмов определяют на культуре клеток. С этой целью 1 гр испражнений разводят в фосфатном буфере 1:1О вес/объем, центрифугируют 3О минут при 4ООО об/мин. Супернатант фильтруют на фильтре 2О нм и вносят в монослой культуры клеток МакКоя и инкубируют при 37 5о 0С 24-48 часов до достижения токсического эффекта (округление клеток).

Иммунохимическое определение продукции токсинов. Используется, как правило, иммуноферментный метод определения многих экзотоксинов - дифтерийного, холерного, стафилококкового и др. Для этого применяются тест-системы на основе моноклональных антител к определенному экзотоксину.

Плазмокоагулаза - фермент, свертывающий плазму крови животных. Определяют в пробирочной реакции. В 1 мл цитратной плазмы кролика или человека (цельной или разведенной в 2 и 4 раза физраствором) размешивают петлю суточной агаровой культуры микроба. Смесь инкубируют в термостате при 37 5о 0С. В положительных случаях через 2-4 часа плазма свертывается (появляется сгусток).

Лецитиназа - см. выше.

Оксидо-редуктазы

1. Определение оксидаз. На фильтровальную бумагу, смоченную 1% раствором тетраметилпарафенилендиамина, петлей наносят полосы испытуемой культуры. В положительном случае появляется фиолетовое окрашивание полос (в течение 1 минуты).

2. Определение каталазы. Каплю 3% раствора перекиси водорода наносят на предметное стекло и туда вносят петлю испытуемой культуры. В присутствии каталазы образуются пузырьки водорода.

3. Определение дегидраз. О наличии дегидраз судят по редуцирующей способности микроба, т.е. способности восстанавливать некоторые органические красители (например, 1% водный раствор метиленовой синьки). К столбику сахарного агара (донатор водорода) добавляют краситель (акцептор водорода) и засевают микробную культуру уколом. В положительных случаях растущий на такой среде микроб ее обесцвечивает.

4. Определение спектра коротко-цепочечных жирных кислот (КЦЖК). Анаэробные микроорганизмы продуцируют промежуточные продукты включающие короткоцепочечные жирные кислоты и спирты, спектр (профиль) которых различен у разных видов микроорганизмов и позволяет проводить идентификацию микроорганизмов до уровня рода.

Наиболее часто исследуют уксусную, пропионовую, бутиловую, изобутиловую, валериановую, изовалериановую, капроновую и изокапроновую аминокислоты. Для определения КЦЖК используют метод газо-жидкостной хроматографии. Идентифицируют такие микроорганизмы как актиномицеты, пропионобактерии, эубактерии, бифидобактерии, клостридии (перфрингенс, спорогенес, дифициле, тертиум).

В последние годы в бактериологических лабораториях применяются коммерчески выпускаемые тест-системы для быстрой биохимической идентификации (для определения биохимической активности разных групп микроорганизмов: например, 2О тестов для энтеробактерий и 3O тестов для анаэробов. Схема идентификации включает следующие этапы:

Колонии---Приготовление---Внесение---Инкубация---Учет(+ -)—Интерсуспензии-- суспензии 4 часа 37 5о 0С –претация в среду

В качестве материала для идентификации используют хорошо изолированную колонию на чашке или чистую культуру в пробирке, из которой готовят суспензию в концентрации стандарта оптической плотности N4, затем по 55 мкл данной суспензии вносят в лунки со средами данной тест-системы. Планшета со стрипами инкубируется при 35 5о 0С 4 часа. Учет может осуществляться либо автоматически (используя прибор АТB) или визуально. Результат биохимической реакции оценивают в виде + или - и вносят в референс-таблицу, в которой положительному результату соответствует численное выражение, в результате чего получается определенный числовой профиль, соответствующий специально разработанному индексу аналитического профиля, позволяющему быстро идентифицировать тот или иной микроорганизм.