Методы изучения нормальной микрофлоры

Для изучения нормальной микрофлоры применяются 2 метода: бактериоскопический и бактериологический.

Бактериоскопический метод имеет большое самостоятельное значение для тех биотопов организма человека, в которых обитает большое количество различных видов микроорганизмов (полость рта, кишечник, вагина). Он позволяет получить общее представление о составе микрофлоры (преобладание грам/+ или грам/- бактерий той или иной формы - кокки, диплококки, стрептококки, палочки, бациллы, стрептобациллы, фузиформные бактерии, наличие грибов и т.д.), а также выявить те микроорганизмы, которые не удается культивировать на питательных средах.

Бактериологический метод  для биотопов с широким спектром микроорганизмов (полость рта, кишечник, вагина) нужно выполнять с учетом данных бактериоскопии.

Основные принципы бактериологического исследования:

• использование качественной (видовой состав) и количественной (количественное соотношение разных видов) оценки микрофлоры;

• первичный посев материала без предварительного обогащения, так как обогащение нарушает количественные соотношения видов;

• использование большого набора различных питательных сред, подбор условий культивирования (аэробные, анаэробные, атмосфера СО 42 и т.д.).

Методы взятия материала для исследования:

1. Получение естественных экскретов (слюна, моча и т.д.);

2. Метод реплик: а) отпечатки на поверхности агаровой среды, б) отпечатки марлево-агаровыми пластинами;

3. Метод смывов увлажненным тампоном;

4. Аспирационный метод (из межзубных пространств, гингивальных карманов, из верхних и средних отделов дыхательных путей, аспирация на фильтры);

5. Введение зондов в кишечник;

6. Метод аппликаций - снятие микроорганизмов с помощью бумажных или тканевых пластинок определенной площади.

Ч А С Т Н А Я М И К Р О Б И О Л О Г И Я

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ПНЕВМОКОККОВЫХ ИНФЕКЦИЙ.

Пневмококк - грамположительный ланцетовидный диплококк, имеет полисахаридную капсулу. Культивируется на средах с белком при рН 7,6 (5% кровяной агар), образует мелкие (средние) уплощенные колонии с гемолизом. Лучше растет при насыщении воздуха СО 42 0. По типу К-антигена имеет 83 варианта. Чувствителен к химическим и физическим факторам (в частности, к солям желчи (лизис), оптохину, NaCl). К факторам патогенности пневмококка относят капсулу, гиалуронидазу, нейраминидазу, экзопротеазу Ig A, О-пневмолизин, лейкоцидин, лизоцим. Патогенен для белых мышей. Пневмококк вызывает острые и хронические заболевания дыхательного тракта (гайморит, бронхит, пневмония), менингит, сепсис, гнойно-воспалительные заболевания, ползучую язву роговицы.

Материал для диагностического исследования берут в зависимости от формы пневмококковой инфекции: например, при пневмонии - мокроту, при сепсисе - кровь, при гнойном заболевании - гной, при отите отделяемое их слухового прохода и т.д. Материал важно забрать до начала этиотропного лечения. Для обнаружения антител исследуют сыворотку крови.

С целью лабораторной диагностики применяют следующие методы:

I. Экспресс-методы (обнаружение возбудителя в исходном материале).

1. Микроскопическое исследование - мазок из патологического материала с окраской по Граму. Обнаружение грамположительных капсульных диплококков;

2. Определение антигена капсулы в реакции «Набухание капсулы» (по Нейфельду - феномен увеличения размеров капсулы в присутствии поливалентной противокапсульной сыворотки). Последняя наносится на мазок исследуемого материала; учет с помощью фазово-контрастного микроскопа;

3. Обнаружение антигена в сыворотке или ликворе (РСК, латекс-агглютинация, встречный иммуноэлектрофорез).

Экспресс-методы чаще являются ориентировочными, так как:

а) не всегда обнаружение пневмококка свидетельствует о его этиологической роли (часто носительство);

б) возбудитель не обнаруживается с началом этиотропного лечения.

2. Культуральный (бактериологический) метод.

1 этап. Материал (не позднее 1-2 часов с момента забора) засевают на 5% кровяной агар, культивируют в эксикаторе со свечой (СО 42 0) 20-24 часа при температуре 37 5о 0С.

2 этап. Отбирают подозрительные колонии, дающие 7 a 0-гемолиз (иногда определяют их количество), микроскопируют (окраска по Граму, на капсулу), отсевают в сывороточный бульон.

3 этап. Определяют чистоту культуры (окраска по Граму).

Идентификацию проводят по морфологическим, серологическим (р. агглютинации на стекле с поливалентной противокапсульной сывороткой), культуральным, биологическим свойствам. Последние проводят путем посева в среду с оптохином (нет роста), в 10% желчный бульон (лизис), внутрибрюшинного заражения мышей (гибель). При необходимости (например, при пневмонии) доказывают этиологическую значимость пневмококка. Определяют также чувствительность к антибиотикам. Культуральный метод является ведущим методом диагностики, так как он - ранний, точный, чувствительный, позволяет выбрать адекватное этиотропное лечение.

III. Серологический метод - определение противокапсульных антител и их динамики в сыворотке крови с помощью РНИФ (с аутоштаммами), РСК и РПГА (с эталонными штаммами пневмококка). Чаще используют при хронических формах инфекции. Применение метода ограничивается более поздними сроками получения результата и отсутствием готовых диагностикумов.

IV. Биологический метод - внутрибрюшинное заражение белых мышей исследуемым материалом (чаще мокротой). Погибших мышей вскрывают, делают мазки-отпечатки, посевы крови и органов на кровяной агар с последующей идентификацией возбудителя. Метод вспомогательный, ограничивается трудоемкостью, наличием в материале других видов микроорганизмов, патогенных для мышей, низкой чувствительностью мышей к некоторым сероварам пневмококка.

ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ ДИАГНОСТИКИ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ,

ВЫЗВАННЫХ МИКРОБАМИ СЕМЕЙСТВА ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ

К ним относятся: эшерихиозы, вызванные условно-патогенными и патогенными (энтеропатогенными, энтерогеморагическими, энтероинвазивными и энтеротоксигенными) кишечными палочками, брюшной тиф, паратифы А и Б, сальмонеллезы, дизентерия, кишечные клебсиеллезы и кишечные иерсиниозы.

Методы их микробиологической диагностики включают следующие принципы:

1. Микроскопический метод диагностики, как правило, не приемлем, так как патогенные и непатогенные энтеробактерии имеют общие морфологические характеристики.

2. Для диагностики применяют бактериологический и серологический методы. Выбор метода диагностики зависит от клинических проявлений, места локализации возбудителя и фазы патогенеза болезни. Так, например, при брюшном тифе самым ранним методом диагностики является бактериологическое выделение возбудителя из крови - гемокультура, что соответствует этапу патогенеза - «бактериемия» (первая неделя клинических проявлений болезни). Начиная со второй недели, в организме человека формируется гуморальный иммунный ответ, поэтому в эти сроки возможна диагностика, основанная на обнаружении антител (постановка реакции агглютинации по Видалю, РПГА, латекс агглютинации). Начиная с третьей недели заболевания возбудитель вновь оказывается в кишечнике и может быть обнаружен бактериологически в испражнениях больного - «метод копрокультуры». Начиная с 6-8 недели болезни, а также в период реконвалесценции, для диагностики бактерионосительства следует использовать как бактериологическое, так и серологическое исследования: многократное исследование копрокультуры, холеркультуры, иногда миелокультура и обнаружение Ви-антител в сыворотке или копрофильтратах.

Бактериологическая диагностика

1. Забор материала. Характер материала зависит от первичной или вторичной локализации микроба-возбудителя. Если материалом служат испражнения, что чаще всего бывает, то их берут до начала или после суточного перерыва в антибактериальной терапии. Материал лучше забирать ректальной трубкой, тампоном со стерильной пеленки или стерильной пергаментной бумаги, специальным устройством для забора фекалий (ни в коем случае не допуская его контакта с дезинфектанатами). Если материалом служит кровь, то забирают 10,0 мл крови из вены локтевого сгиба.

2. Транспортировка материала осуществляется в системе «стекло, металл» в течение не более трех часов после его забора или в консерванте с сопровождающими документами медицинским работником.

3. Питательные среды, используемые для бактериологического исследования можно подразделить на три группы: а) среды обогащения, создающие условия преимущественного размножения выделяемого возбудителя и основанные либо на принципе наличия в среде факторов активации роста данного микроба, либо на принципе подавления роста сопутствующих микробов-антагонистов. Первой группе соответствует среда Раппопорта, второй - селенитовая, магниевая, Мюллера, с пенициллином и т.д.; б) среды дифференциально-диагностические. Это плотные питательные среды, содержащие дифференцирующий углевод - лактозу и индикатор. Кишечные палочки, разлагающие лактозу (лактозоположитель-ные), растут в виде окрашенных колоний в зависимости от типа среды в красный и оранжевый (среда Эндо, Плоскирева) или фиолетовый (среда Левина) цвет. Клебсиеллы пневмонии разлагают лактозу в среде с индикатором бромтимоловым синим и образуют колонии желтого цвета, в то время как колонии лактозоотрицательных биоваров формируют колонии цвета среды. Сальмонеллы и шигеллы на средах Эндо, Левина, Плоскирева также не разлагают лактозу и дают бесцветные колонии; в) среды накопления чистой культуры. Чаще применяется среда Олькеницкого (скошенный агар): она состоит из столбика, скошенной части и включает лактозу, глюкозу и сахарозу, индикатор, реагенты для определения сероводорода и уреазы. Посев производят уколом в столбик и штрихом по поверхности скошенной части. При росте микробов глюкоза лучше разлагается в столбике, лактоза - на скосе, в результате чего дифференцированно меняется цвет среды, при образовании газа - формируются пузырьки и разрывы в среде, при продукции сероводорода - почернение по ходу укола, а - уреазы - изменение цвета среды на оранжевый.

4. Идентификация выделенных культур основана на определении:

• общего для семейства признака - морфологии бактерий (гр/-палочки), оксидазоотрицательные, наличия капсулы (у клебсиелл);

• цвета колоний на чашечных средах;

• подвижности (сальмонеллы и эшерихии подвижны, шигеллы и клебсиеллы неподвижны);

• биохимических свойств;

• антигенной структуры;

• чувствительности к антибактериальным препаратам;

• чувствительности к бактериофагам.

Определение антигенной структуры основано на предварительном установлении серогруппы, чаще с монорецепторными адсорбированными сыворотками, а затем серовара тоже с адсорбированными сыворотками.

Серологическая диагностика

Серологическая диагностика начинается с получения сывороток от больных. В них обнаруживаются антитела в реакции агглютинации, гемагглютинации или РСК. Диагноз основан на обнаружении антител в диагностическом титре или нарастании титра антител в динамике болезни.

Диагностика кишечных эшерихиозов (колиэнтеритов).

Цель: выделение чистой культуры эшерихий и отличие ее от условно-патогенных представителей нормальной микрофлоры кишечника.

Метод: бактериологический.

Материал для исследования: фекальные массы.

Схема: 1 - посев на среду Эндо (Левина)

2а - обнаружение окрашенных колоний, микроскопия их по Граму

2б - предварительная дифференциация патогенных эшерихий от условно-патогенных: постановка РА на стекле со смесью сывороток к патогенным серогруппам

2в - положительно реагирующая в реакции агглютинации колония отсевается на среду Олькеницкого

3а - учет изменения среды Олькеницкого: посинение и разрыв всей среды

3б - определение чистоты выделенной культуры

3в - определение серовара патогенной эшерихии (путем постановки р. агглютинации с отдельными ОК-сыворотками на стекле и в пробирках) с живой (определение К-антигена) и убитой кипячением (определение О-антигена) культурой

3г - проба на индол, подвижность и чувствительность к антибиотикам

Серологический метод - постановка реакции агглютинации с сывороткой больного (на 2-ой неделе заболевания).