Методы выделения чистых культур микроорганизмов

1. Метод механического разобщения микроорганизмов.

а) Посев материала на чашки Петри шпателем или петлей (см. практикум).

б) Посев пластинчатыми разводками - делают в пробирках десятикратные разведения материала в расплавленном и остуженном до 45 5о 0С МПА, а затем выливают содержимое пробирок в стерильные чашки Петри, дают агару застыть и инкубируют чашки в термостате.

в) Разобщение на основе подвижности микробов. Материал засевают в каплю конденсационной жидкости скошенного МПА. При этом подвижные микробы как бы «мигрируют» вверх по агаровому скосу и вырастают в виде колоний, расположенных в верхней части агара. При 2-3-кратном пассировании этих колоний в конденсационную жидкость скошенного агара удается получить чистую культуру подвижного микроба (например, протея).

г) Разобщение на основе различий в размерах микроорганизмов. Для этого смесь микроорганизмов фильтруют через микро- и миллипористые фильтры. Чистые культуры получают, как правило, в фильтрах. Этот метод используют для получения чистых культур вирусов и микоплазм.

2. Метод заражения чувствительных лабораторных животных (биологический).

Основан на избирательной чувствительности организма животного к микробам различных видов, что выражается в быстрой скорости размножения определенного вида при попадании его в кровь и внутренние органы, откуда его и выделяют. В то же время другие виды микробов погибают под действием защитных факторов организма. Таким образом выделяют, например, чистую культуру пневмококков из организма белой мыши, палочки туляремии из организма морской свинки.

3. Методы, основанные на избирательной чувствительности

Микроорганизмов к воздействию внешних факторов.

а) Температуры: спорообразующие микробы выживают при нагревании смеси микробов, в то время, как неспорообразующие - гибнут.

б) Кислот: при обработке смесей кислотоустойчивых и неустойчивых к кислотам микробов, последние гибнут, а кислотоустойчивые остаются, как правило, в чистой культуре. Так выделяют возбудителя туберкулеза.

в) Антибиотиков: основан на избирательной чувствительности определенных видов микробов к отдельным антибиотикам. При посеве смеси микробов на среду с добавлением антибиотика, вырастают нечувствительные к нему микробы.

г) Анаэробных условий: дает возможность отделить группу анаэробных микроорганизмов от облигатных аэробов.

СХЕМА ИНДЕНТИФИКАЦИИ МИКРОРГАНИЗМОВ ПО ПРИЗНАКАМ

(ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИДА)

(СМ. ФАЙЛ «СХЕМА ИНДЕНТИФИКАЦИИ)

ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МИКРОБОВ

Этот метод предусматривает изучение ферментативной деградации различных субстратов (углеводородов, аминокислот и белков, мочевины, перекиси водорода и др.) с образованием промежуточных и конечных продуктов.

КАРБОГИДРАЗЫ - ферменты, разлагающие углеводы. Определяя карбогидразы, выявляют т.н. сахаролитические свойства микробов. С этой целью используют следующие среды:

а) Среды Гисса (жидкие и полужидкие с индикаторами). В качестве последних используют реактив Андреде, бромтимоловый синий или ВР. О ферментативной активности бактерий судят по изменению цвета среды и образованию газа.

б) Дифференциально-диагностические среды с лактозой (Эндо, Левина, Плоскирева и др.).

в) Полиуглеводные среды (типа Олькеницкого, Клиглера и др.).

ПРОТЕАЗЫ - ферменты, разлагающие белки.

а) Исследуемая культура может расщеплять белки субстрата с образованием пептона, альбумоз, аминокислот. Этот процесс идет за счет ферментов-протеиназ и пептидаз. Для выявления указанных ферментов исследуемую культуру засевают на ряд сред: свернутая сыворотка, столбик желатина (разжижение в положительных случаях), молочный агар в чашке Петри (в положительных случаях вокруг колоний появляются зоны помутнения).

б) Расщепление аминокислот микробами может идти путем декарбоксилирования, либо путем дезаминирования. В первом случае из той или иной аминокислоты образуются амины, которые выявляются либо методом элекрофореза, либо по подщелачиванию среды. О наличии дезаминаз у микроба судят по образованию аммиака в среде, как результат процесса дезаминирования аминокислоты.

в) Расщепление аминокислоты триптафана за счет действия фермента триптафаназы сопровождается образованием индола. Последний выявляется с помощью бумажки, смоченной щавелевой кислотой и укрепленной под пробкой над питательной средой. В положительных случаях бумажка краснеет.

г) Для выявления ферментов расщепления серосодержащих аминокислот (цистин, цистеин) ставят пробы на H 42 0S, как продукт расщепления этих аминокислот десульфуразами. Наличие H 42 0S выявляется и в среде Олькеницкого.

д) Для выявления уреазы - фермента, расщепляющего мочевину - в питательную среду нейтральной рН добавляют мочевину и индикатор. В положительных случаях среда изменяет цвет за счет сдвига рН в щелочную сторону в связи с образованием аммиака.

ЛИПАЗЫ - ферменты разложения липидов и липоидов. Чаще всего определяют лецитиназу посевом на желточный агар. Лецитиназа расщепляет лецитин на фосфохолин и диглицерид в этих случаях при росте колоний вокруг них появляются опалесцирующие зоны, отражающие лецитиназную активность.