Лабораторная диагностика ботулизма

Возбудитель ботулизма - Cl. botulinum - крупная палочка с субтерминальной овальной спорой («теннисная ракетка»), грам+, подвижная, без капсулы, обладает выраженными протеолитическими свойствами. Основную роль играют серовары А, В, Е.

Материалом для исследования служат кровь, рвотные массы, промывные воды желудка, моча, испражнения, подозрительные на заражение пищевые продукты. Микробиологическая диагностика проводится аналогично для других клостридиозов. Наиболее информативный метод диагностики - реакция нейтрализации на белых мышах с использованием противоботулинических сывороток. Эту реакцию ставят непосредственно с исследуемым материалом, либо с выделенной культурой. Животные, не защищенные сыворотками, погибают при явлениях общей слабости, отдышки, порезов и параличей конечностей, западение мышц живота («осиная талия»).

Диагностика столбняка

Возбудитель столбняка - Cl. tetani - крупная тонкая палочка с круглой спорой на конце (барабанная палочка), грам+, подвижная, без капсулы. Обладает слабыми протеолитическими свойствами.

Диагностика проводится по той же схеме, что и газовая гангрена. Наибольшее значение имеет биопроба на мышах и опыт нейтрализации. Картина экспериментального столбняка: хвост мыши становится ригидным, задняя конечность вытягивается, туловище искривляется (восходящий столбняк), животное погибает.

Для ускоренного выделения палочек столбняка используют засев материала (или смешанной культуры со среды Китта-Тароцци) конденсационную воду скошенной свернутой сыворотки(метод Филдса). Благодаря активной подвижности клостридий столбняка за 24 часа вырастают на верхней части косяка. Культура исследуется микроскопически и ею заражают белых мышей.

Лабораторная диагностика холеры

Обследованию подлежат не только больные, но обязательно все люди в очаге для выявления скрытых форм и бактерионосителей. Забор материала проводится в условиях, обеспечивающих полную безопасность персонала и внешней среды, обязательно медицинским работником. Материал от больного берется индивидуально, от подозреваемых лиц - можно объединять по несколько проб. Материал для исследования: испражнения, кусочки кишечника от трупов, пищевые продукты, вода, объекты внешней среды. Пересылка материала осуществляется медицинским работником в течение не более 3,5 часов в системе стекло - впитывающий материал - металл с приложением сопроводительного письма (в нем указаны паспортные данные, предполагаемый диагноз, время взятия материала) и пометкой «бактериологическое загрязнение».

Используют два метода: главный - бактериологический, дополнительный - серологический.

Бактериологическое исследование проводят в специальных лабораториях с соблюдением строгого противоэпидемического режима.

Методы диагностики подразделяются на классические и ускоренные.

Классическое исследование проводится поэтапно, через каждые 6 часов.

1 этап. а) посев материала для обогащения на 1% пептонную воду; б) микроскопия материала (окраска по Граму и фуксином); в) посев материала на щелочной агар и среду TCBS (тиосульфатцитрат-бром-тимоловый синий, сахароза). Посевы помещают в термостат.

2 этап (через 6 часов). а) вырастает пленка на пептонной воде, делают пересев на вторую пептонную воду для дальнейшего обогащения; б) пересев из первой пептонной воды на щелочной агар и среду TCBS.

3 этап (через 12 часов исследования). а) исследование роста на второй пептонной воде (аналогично первой); б) изучение чашек первичного посева: - описание колоний (жел-тые на TCBS, прозрачные голубоватые на щелочном агаре; - микроскопия; - определение подвижности; - постановка РА на стекле с 0-1, Инаба и Огава сыворотками; просмотр колоний в стереоскопическом микроскопе (голубоватый цвет); - пересев на двухсахарную лактозо-сахарозную среду. На этом этапе может быть дан предварительный ответ.

4 этап (через 18 часов исследования). Изучение выросшей культуры: а) учет изменения лактозо-сахарозной среды (разложение сахарозы в столбике без газа); б) мазок по Граму; в) идентификация по ряду признаков.

1. Для постановки окончательного диагноза и отличия выделенных вибрионов от нехолерных:

• РА с сывороткой 0-1 (в пробирках);

• посев на триаду сахаров Хейберга: сахарозу (+), маннозу (+) и арабинозу (-);

• определение чувствительности к холерным фагам С4 и Эльтор-2.

2. Для определения серовара: РА с сыворотками Огава и Инаба (в пробирках).

3. Для определения биовара холерного вибриона:

• чувствительность к бактериофагам (классический вибрион - КС4, Эльтор - к фагу Эльтор-2;

• рост на среде с полимиксином;

• агглютинация куриных эритроцитов;

• лизис бараньих эритроцитов.

Все три последних положительны для вибриона Эль-Тор.

Длительность исследования - 36-48 часов в зависимости от скорости обогащения.

Ускоренный метод диагностики подразделяется на: ускоренный метод индикации микроба, антигена и ускоренную идентификацию.

А. Ускоренная индикация - поиск микроба непосредственно в материале или после подращивания в пептонной воде следующими методами:

а) микроскопия (по Граму и фуксином);

б) прямая РИФ;

в) р. иммобилизации под действием сыворотки 0-1;

г) р. агглютинации растущих культур (материал засевается в 2 пробирки с пептонной водой, в одну из них добавляют диагностическую сыворотку, отмечается рост и одновременно склеивание микробов в пробирке с сывороткой);

д) проба с бактериофагами.

Б. Поиск антигена в материале серологическими методами:

а) р. энзим-меченных антител;

б) РПГА с антительным диагностикумом;

в) РТПГА.

В. Ускоренная идентификация осуществляется на 3-ем этапе бактериологического исследования путем изучения свойств выросших колоний (мазок по Граму, р. агглютинации с сывороткой 0-1, посев в малые объемы трех углеводов по Хейбергу, проба с бактериофагом.

Серологический метод диагностики. Чаще носит ретроспективный характер, помогает в неясных случаях и для выявления переболевших и вибриононосителей. Используют РА и определение вибриоцидных антител. Рекомендуют использовать парные сыворотки. Положительный ответ дают при наличии высокого титра (в РА - 1:180-1:3200) или при нарастании его в парных сыворотках.

КАМПИЛОБАКТЕРИИ. КАМПИЛОБАКТЕРИОЗЫ.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ.

Кампилобактерии - род Campylobacter семейства Spirillaceae - это тонкие изогнутые грам- палочки, образующие один или несколько завитков, могут быть S-образными или похожими на «крылья чайки». Толщина клеток - 0,2-0,5 мкм, длина - 0,5-8 мкм. Спор и капсул не образуют, подвижны, имеют полярно расположенный жгутик на одном конце или по жгутику на обоих концах клетки. Для них характерны быстрые винтообразные движения. Хемоорганотрофы, микроаэрофилы (растут при пониженном парциальном давлении кислорода).

Род включает более 10 видов. Некоторые виды патогенны для человека, вызывают кишечный кампилобактериоз. Патогенные виды отличаются от непатогенных продукцией каталазы. Каталаза-отрицательные кампилобактерии входят в состав нормальной микрофлоры полости рта и кишечника человека и различных животных.

Наибольшее значение в развитии заболеваний у людей имеет C. jejuni (95%), реже - C. coli, еще реже - C. fetus и C. laridis. Заболеваемость кампилобактериозом носит спорадический характер, возникает при употреблении в пищу инфицированного мяса птицы, телят, свиней, могут быть вспышки молочного или водного характера. Болеют дети и взрослые, в наибольшей степени заболеванию подвержены дети в возрасте до 4 лет ( в 90% случаев).

Кампилобактерии поражают тонкий кишечник. Они прикрепляются к поверхности энтероцитов, оказывают цитотоксическое действие (выделяют энтеротоксин); обладают высокой инвазивностью, что приводит к бактериемии (у ослабленных лиц может быть сепсис). Клинически заболевание проявляется острым гастроэнтеритом, который по тяжести варьирует от кратковременной диареи до тяжелого кровавого поноса с высокой температурой и явлениями интоксикации. Летальность невелика. Иммунитет изучен плохо.

Диагностика кампилобактериоза может проводиться по короткой или полной схеме. Материал - испражнения, рвотные массы, ПВЖ (промывные воды желудка).

Короткая схема включает широкое бактериоскопическое исследование :

• фазовоконтрастную микроскопию для выявления подвижности (клетка сжимается в кольцо и разжимается как пружина),

• простую окраску препаратов (окрашиваются анилиновыми красителями за 20 секунд, энтеробактерии - за 2-3 минуты),

• окраску по Граму (выявление характерной морфологии).

На практике при наличии характерной клиники (диареи) достаточно короткой схемы исследования.

Полная схема (бактериологический метод) проводится только с материалами, в которых при микроскопии обнаружены кампилобактерии. При этом, во многих случаях достаточно идентификации до группы C. Jejuni - coli. При проведении исследования необходимы условия:

1. Наличие высококачественных питательных сред, содержащих редуцирующие вещества (активированный уголь), витамины, 5% лизированной крови (источник гемина), 5% свежей крови (эритроциты - дополнительный сорбент метаболитов), антибиотики (амфоте-рицин и др.) для подавления сопутствующей микрофлоры.

2. Культивирование в присутствии СО 42 0 или специальных газовых смесей (5% кислорода, 10% СО 42 0, любой инертный газ). Можно использовать эксикаторы со свечей или надувать двойные полиэтиленовые пакеты выдыхаемым воздухом.

3. Культивирование при различных температурах (25 5o 0, 30 5o 0, 37 5o 0, 42 5o 0 С) и дифференциация по чувствительности к налидиксовой кислоте и цефалотину. При наличии роста нежных полупрозрачных колоний грам- подвижных палочек при 42⁰С, чувствительных к налидиксовой кислоте и устойчивых к цефалотину, выдается ответ: C.jejuni-coli.

В начале 80-х годов были выделены так называемые «желудочные» кампилобактерии, обозначенные как C. pyloridis. В дальнейшем они были исключены из рода Campylo-bacter и получили название Helicobacter pylori. Отличаются от кампилобактерий внутриклеточным паразитизмом и продукцией уреазы (кампилобактерии уреазу не продуцируют). Обладают цитотропизмом к клеткам эпителия желудка и кишечника, являются возбудителями язвенной болезни желудка и 12-перстной кишки. По современным представлениям, язвенная болезнь в 99% случаев - это хеликобактериоз.

Лабораторная диагностика хеликобактериоза несколько отличается от кампилобактериоза :

1. Материал для исследования - биоптаты.

2. Гомогенизация материала.

3. Почти не применяется бактериологический метод.

Для диагностики используется комплексная микроскопия и определение уреазы в исследуемом материале. Хеликобактеры плохо красятся по Граму и не красятся простыми методам, поэтому используют специальные методы окраски, а также проводят исследования в фазово-контрастном и люминесцентном микроскопе.