ЗАНЯТИЕ № 31 ТЕМА: ГЕПАТОТРОПНЫЕ ВИРУСЫ

ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ ВОПРОСОВ

1. Вирусные гепатиты A, B, C, D, E, G. Этиология. Сравнительная характеристика основных биологических свойств возбудителей вирусных гепатитов.

2. Вирус гепатита А. Структура и свойства HAV. Пути проникновения и циркуляция в организме. Патогенез, клиника, исход заболевания. Лабораторная диагностика гепатита А. Иммунитет, специфическая профилактика, лечение.

3. Вирус гепатита E. Структура вируса. Эпидемиология, клинические формы, исход заболевания. Вирусологическая и серологическая диагностика.

4. Гепаднавирусы. Морфология, особенности репродукции вируса гепатита В. Структура генома, антигены, полипептидные фрагменты HBs-Ag, подтипы вируса.

5. Гепатит В: эпидемиология, патогенез, клинические формы течения заболевания, исходы. Лабораторная диагностика. Иммунитет, специфическая профилактика, лечение.

6. Гепатит D. Особенности строения вируса. Характеристика заболевания: коинфекция, суперинфекция. Лабораторная диагностика, профилактика.

7. Гепатит С: классификация вируса, ультраструктура, антигены. Общая характеристика заболевания, исходы заболевания. Диагностика гепатита C: скрининговые методы, подтверждающие тесты.

8. Гепатит G: возбудитель, вирусологическая диагностика. Посттрансфузионный гепатит TTV: характеристика вируса, вирусологическая диагностика.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Лабораторная диагностика гепатита А (инкубационный период 14-45 дней)

Исследуемый материал:кровь (сыворотка), фекалии, вода и пищевые продукты

Выявление антигена (реакции)ИФА - антиген вируса (HAVAg) выявляют в экстрактах фекалий со 2-й недели и до конца болезни;

Выявление вируса (методы) Иммунная электронная микроскопия (ИЭМ), в научных и производственных целях используют заражение обезьян и культур клеток

Выявление антител (классы Ат, сроки, реакции) ИФА, РИА IgM 4-8 недели, IgG с 4 недели, остаются на всю жизнь

Генодиагностика (сроки, реакции) ПЦР - РНК вируса (HAV RNA)

Динамика появления серологических маркеров гепатита А

Оценка результатов серологического исследования 1.Антиген HAV обнаруживается в конце инкубационного, весь продромальный период, но при манифестации инфекции с появлением желтухи исчезает (показатель заразности инфекции!). 2.Основным диагностическим критерием текущей или свежеперенесенной инфекции являются антитела класса IgM (показатель заразности инфекции!). 3.Антитела класса IgG появляются на поздних стадиях заболевания, сохраняются в течение длительного времени и свидетельствуют о перенесенном заболевании.

Лабораторная диагностика гепатита В (инкубационный период 2- 6 месяцев)

Исследуемый материал кровь (сыворотка), биоптаты печени

Выявление антигенов (очередность, сроки, длительность) ИФА, РПГА в сыворотке крови определяют поверхностный антиген HВsAg 1-5 месяцев, “антиген инфекционности” HBеAg 2-3 месяца; HBс Ag в крови не циркулирует в свободном виде, его можно обнаружить только в биоптатах печени- в ядрах гепатоцитов

Выявление антител (классы Ат, сроки, реакции) ИФА, РПГА в сыворотке крови определяют: антитела к поверхностному антигену (анти-HВsAg)- с 6 месяцев; антитела к “антигену инфекционности” анти-HВеAg с 4-5 месяцев). Антитела к сердцевинному антигену (анти-HВсAg IgM и антиHВcAg IgG) служат индикатором вирусемии и могут определяться в гепатоцитах методом РИФ с 2 месяцев;

Генодиагностика.Выявление НК (сроки, реакции) ДНК (HBV DNA вируса в крови и биоптатах печени с момента заражения до выздоровления (в среднем 6 месяцев) методом ПЦР и молекулярной гибридизации . 

Динамика появления серологических маркеров гепатита В

Оценка результатов серологического исследования 1. HBsAg выявляется в крови в последние дни инкубационного периода, достигает максимальных концентраций в период острых клинических проявлений (желтуха, повышение уровней АлАТ, АсАТ, билирубина и др.). В большинстве случаев HBsAg исчезает в течении 3-5 недель от начала заболевания. Персистенция HBsAg (>6 месяцев) – предиктор хронизации гепатита. 2. HBeAg выявляют при ОГВ в течение 6-8 недель. Более длительная его персистенция указывает на хронизацию инфекции. 3. Присутствие анти-НВe класса IgM достоверно свидетельствует об остром гепатите В 4. Антитела к HBe обнаруживаются после появления анти - НВс класса IgM и исчезают в течение года у 50% пациентов. 5. Анти-HBs-антитела можно выявить через 1-3 месяца после исчезновения HBs-антигена. Они присутствуют в крови в течение 4-5 лет.

Интерпретация результатов серологического обследования на гепатит В

Серологический диагноз	HBsAg	Анти-HBs	анти-НВс суммарные		HBеAg	Анти-HBе	ДНК ВГВ, копий/мл
			HBc IgМ	HBc IgG
Острый гепатит В	+/–	–/+	+	+	+/–	–/+	+/–
Хронический интегративный ГВ (носительство HBsAg)	+	–	–	+	–	+	<105
Хронический репликативный ГВ	+	–	+/–	+	+/–*	–/+*	>105
Иммунитет после вакцинации	–	+	–	–	–	–	–
Иммунитет после перенесенного ГВ	–	+	–	+	–	+/–	–

Лабораторная диагностика гепатитов C, D, E

Гепатит С (инкубационный период 2 недели -3месяца)

Исследуемый материал кровь (сыворотка), биоптаты печени

Скрининговые тесты: выявление в донорской крови антител к белкам капсида (С22) и функциональным белкам (NS3-NS5) вируса тест-системами третьего поколения ИФА-3,

Подтверждающие тесты в образцах с первично положительным результатом ИФА проводят:

1. ИФА с раздельным определением антител к различным белкам вируса,

2. иммуноблоттинг с использованием рекомбинантных антигенов к белкам капсида (С22) и функциональным белкам (NS3-NS5).

Оценка результатов иммуноблотанализа положительный при выявлении антител к двум и более АГ

Генодиагностика РНК вируса (HCV RNA) методом ПЦР и молекулярной гибридизации на протяжении болезни

D (инкубационный период 2 недели -6 месяцев)

Исследуемый материал кровь (сыворотка), биоптаты печени

Выявление антигенов (антигены, реакции) ИФА, РИА, иммуноблотинг - антиген вируса (HDVAg)

Выявление антител (реакции) Сыворотка крови ИФА - анти-HDV IgM, анти-HDV IgG.

Генодиагностика ПЦР, метод молекулярной гибридизации - РНК вируса (HDV RNA

Гепатит Е (инкубационный период 14-45 дней)

Исследуемый материал: кровь (сыворотка), фекалии, вода и пищевые продукты

Выявление антигена (реакции) ИФА - антиген вируса (HЕVAg),

Выявление вируса (методы) Иммунная электронная микроскопия( ИЭМ),

Выявление антител ИФА - анти-HЕV IgM в начале заболевания , анти-HЕV IgG после заболевания)

Генодиагностика сыворотка крови, кал обнаружение РНК вируса (HEV RNA) в ПЦР на протяжении болезни

Сравнительная характеристика вирусных гепатитов

Гепатиты	А (HAV)	B (HBV)	С (НСV)	D (HDV)	Е (НЕV)	G (HGV)
Таксономия возбудителя	Сем. Picornaviridae Род. Hepatovirus	Сем. Hepadnaviridae Род. Ortohepadnavirus	Сем. Flaviviridae Род. Hepacivirus	Неклассифицирован, вирус-сателлит (вироид) HBV	Сем. Hepeviridae Род. Hepavirus	Сем. Flaviviridae неклассифицирован,
Морфология (форма, размер, наличие суперкапсида)	простой вирус, капсид икосаэдр 25-30 нм	сложный вирус сферической и палочковидной формы 42 нм	сложный вирус сферической формы 55-65 нм	сложный вирус сферической формы 35-40 нм.	простой вирус икосаэдр 27-34нм	сложный вирус сферической формы 60 нм
Геном	+ РHK, линейная, нефрагментированная	ДНК кольцевая, двунитевая с однонитевым участком	+ РHK, линейная, нефрагментированная	- РHK, кольцевая	+ РHK, линейная, нефрагментированная	+ РHK, линейная, нефрагментрованная
Пути передачи	Фекально-оральный	Парентеральный	Парентеральный	Парентеральный	Фекально-оральный	Парентеральный
Инкубацион-ный период	14-45 дней	2- 6 месяцев	14 дней - 3 месяца	2 - 6 месяцев	14-45 дней	14 дней - 6 месяцев
Клинические проявления	Острые гепатиты	Часто хронический гепатит, цирроз, нередко рак	Часто хронический гепатит, цирроз, часто рак	Часто хронический гепатит, цирроз, нередко рак	Острые гепатиты, тяжело протекают у беременных	Часто хронический гепатит
Специфичес-кая профилак-тика	Инактивированная культуральная по эпид. с 3 лет, ревакцинация через 4 года	Рекомбинантная, плановая с 1996 года. 12час, 1месяц,3 месяца ревакцинация через 5 лет	Нет	Вакцина против гепатита В из-за общности поверхностного HBsAg	Инактивированная культуральная по эпид. с 3 лет.	Нет
Исследуемый материал	сыворотка крови, фекалии, вода и пищевые продукты.	сыворотка крови, биоптаты печени	сыворотка крови, биоптаты печени	сыворотка крови, биоптаты печени	сыворотка крови, фекалии, вода и пищевые продукты	сыворотка крови, биоптаты печени
Маркеры	HAV РНК, HAV Ag, anti-HAV IgM, IgG	HBV ДНК, HBsAg, HBeAg, anti-HBsAg, anti-HBeAg, anti-HBc IgM, IgG	HCV РНК, anti-HCV IgM, anti-HCV IgG	HDV РНК, HDAg, anti-HDV IgM, IgG	HEV PНК, HEV Ag, anti-HEV IgM, IgG,	HGV РНК, anti-HGV
Экспресс-диагностика	1) ПЦР - РНК вируса (HAVRNA) выявляют в сыворотке крови, фекалиях, воде и пищевых продуктах. 2) ИФА - антиген вируса (HAVAg) выявляют в экстрактах фекалий; 3) Иммунная электрон-ная микроскопия (ИЭМ).	1) ПЦР, метод молекулярной гибридизации - ДНК вируса (HBV DNA) в крови, биоптатах печени. 2) ИФА, РПГА в сыворотке крови определяют антигены вируса : поверхностный антиген (HВsAg), “антиген инфекционности” (HВеAg);	ПЦР, метод молекулярной гибридизации в сыворотке крови - РНК вируса (HCV RNA) 2)	1) ПЦР, и метод молекулярной гибридизации - РНК вируса (HDV RNA) ; 2) ИФА, РИА, иммуноблотинг - антиген вируса (HDV Ag) .	1) ПЦРобнаружение РНК вируса (HEV RNA) всыворотке крови, испражнениях 2) ИФА - антиген вируса (HЕVAg),	ПЦРс предварительным этапом обратной транскрипции(RT-PCR) обнаружение РНК вируса (HGV RNA) ;
Вирусологичес-кие методы	Заражение клеточных культур, обезьян (шимпанзе) только для научных и производственных целей, в диагностике не применяют	Заражение обезьян (шимпанзе) только для научных целей, в диагностике не применяют	Нет	Нет	Нет	Нет
Серологическаядиагностика	ИФА, РИА в сыворотке крови выявляют Ig M-антитела (анти-HAV IgM) и Ig G-антитела (анти-HAV IgG).	ИФА, РПГА в сыворотке крови определяют противовирусные антитела: антитела к поверхностному антигену (анти-HВsAg); антитела к сердцевинному антигену (анти-HВсAg IgM, IgG; антитела к “антигену инфекционности” (анти-HВеAg);	ИФА, в сыворотке антитела к вирусу (анти-HCV IgM, анти-HCV IgG) В донорской крови 1) ИФА с раздельным определением антител к различным белкам вируса, 2) иммуноблоттинг с рекомбинантными антигенами к белкам капсида (С22) и функциональным белкам (NS3-NS5) для выявления антител.	ИФА в сыворотке крови - антитела к вирусу (анти-HDV IgM, анти-HDV IgG).	ИФА в сыворотке крови - антитела к вирусу (анти-HЕV IgM, анти-HЕV IgG	ИФА в сыворотке крови - антитела против вирусного белка Е2 (анти-HGV Е2)

Иммуноблоттинг — метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА. Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят их (блоттинг - от англ. blot, пятно) из геля на нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Полоски с “блотами” антигенов выпускаются различными фирмами. 1. На эти полоски наносят сыворотку больного. 2. Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом. 3. Образовавшийся на полоске комплекс [антиген + антитело больного + антитело против Ig человека] выявляют добавлением хромогенного субстрата, изменяющего окраску под действием фермента.

Иммуноферментный анализ, или метод (ИФА) — выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, бета-галактозидазой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченой ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расщепляется ферментом и изменяется цвет продукта реакции — интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител

Иммунная электронная микроскопия – электронная микроскопия чаще вирусов, обработанных соответствующими антителами. Вирусы, обработанные иммунной сывороткой, образуют иммунные агрегаты (микропреципитаты). Вокруг вирионов образуется “венчик“ из антител, контрастированный фосфорно-вольфрамовой кислотой или другими электроннооптически плотными препаратами хорошо видимый в электронном микроскопе.

Радиоиммунный анализ (РИА), — высокочувствительный метод, основанный на реакции антиген — антитело с применением антигенов или антител, меченных радионуклидом (125J, 14С, 3Н, 51Сr и др.). После их взаимодействия отделяют образовавшийся радиоактивный иммунный комплекс и определяют его радиоактивность в соответствующем счетчике (бета- или гамма-излучение): интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) основана на амплификации, т. е . увеличении количества копий специфического (маркерного) гена возбудителя . Для этого двунитевую ДНК, выделенную из исследуемого материал а, денатурируют ( «расплетают» при нагревании) и достраивают (при охлаждении) к расплетенным нитям ДНК новые комплементарные нити . В результате из одного гена образуются два. Этот процесс копирования генов многократно по вторяется при заданных температурных режимах . Достраивание новых комплементарных нитей ДНК происходит при добавлении к искомым генам прай меров (затравки из коротких однонитевых ДНК, комплементарных 3'- концам ДНК искомого гена), ДНК - полимеразы и нуклеотидов. Для амплификации РНК вирусов применяют ПЦР с предварительным этапом обратной транскрипции (RT-PCR).