ЗАНЯТИЕ № 5

ТЕМА: БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МИКРООРГАНИЗМОВ. МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР АЭРОБНЫХ И АНАЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ. БАКТЕРИОФАГИЯ.

ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ ВОПРОСОВ

1. Ферменты бактерий, классификация. Способы изучения биохимических свойств микроорганизмов. Практическое использование биохимической активности в идентификации бактерий

2. Определение сахаролитических свойств, состав сред Гисса; определение протеолитических свойств, определение каталазной и оксидазной активности.

3. Принцип работы и особенности применения приборов автоматической идентификации бактериальных культур (гемокультиватор, автоматический анализатор).

4. Особенности культивирования риккетсий и хламидий.

5. Бактериофаги (фаги). История открытия. Морфология, структурные особенности, химический состав и свойства фагов.

6. Вирулентные фаги. Фазы взаимодействия с бактериальной клеткой. Результаты взаимодействия фага и клетки. Умеренные фаги. Профаг. Явление лизогении. Фаговая конверсия.

7. Методы выделения и титрования бактериофагов на плотных и жидких питательных средах. Применение фагов в микробиологии и медицине. Фагодиагностика и фаготипирование.

ЛАБОРАТОРНАЯ И САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА

1

Способы изучения биохимических свойств бактерий:

1."Пестрый ряд" (среды Гисса). Состав: 1% пептона +0,5% NaCl+0,4% ага-агар+ 1% углевода+ 1% индикатора (бромтимолового синего- синий- к+-желтый, Андреде фуксин –бледно-розовый -- к+-красный, ВР-водный голубой и розоловая кислота –бесцветный- к+синий;

Принцип действия при разложении образуется К или КГ

2.Система индикаторных бумаг - СИБы. Принцип действия: бумажки содержащие углевод + индикатор, помещают в пробирки с физ. р-р – вносят взвесь микроорганизмов при разложении образуется К или КГ

3.Панель биохимической дифференцировки энтеробактерий - пбдэ.

Принцип действия лунки пластиковой панели содержат углевод + индикатор или аминокислоту + индикатор, вносят взвесь микроорганизмов в физ. р-р - при разложении образуется К или КГ

Изучение биохимических свойств микроорганизмов для идентификации бактерий

А) Посев культуры (стафилококка, эшерихий) со скошенного МПА уколом на "пестрый ряд" Гисса. Б) Определение каталазной активности (стафилококк+, эшерихии+).

В) Учет результатов биохимической активности эшерихий и стафилококка в готовых посевах на "пестром ряду" Гисcа (заполнение таблицы):

Сахара (определение сахаролитических ферментов)						МПБ (определение протеолитических ферментов)
	Лак-тоза	Глю-коза	Манн-нит	Маль-тоза	Саха-роза	Индол - индикаторная бумага пропитана раствором щавелевой кислоты (при выделении индола - она краснеет)	Сероводород индикаторная бумажка пропитана уксуснокислым свинцом (при выделении Н2S - она чернеет)
E.coli	КГ+	КГ+	КГ+	-	-	+
S. aureus	К+	К	К	К	К	+	-

Примечание: при выделении в чистой культуре стафилококка дополнительно учитываются признаки патогенности по демонстрационным посевам (гемолиз на кровяном агаре, лецитиназа на ЖСА (радужный венчик), реакция плазмокоагуляции (образование плотного сгустка из плазмы крови);

В) Определение каталазной активности:Катала́за (оксидоредуктаза) фермент, катализирующий реакцию разложения перекиси водорода на воду и молекулярный кислород: Н₂О₂ + Н₂О₂ = О₂ + 2Н₂О. При внесении в каплю 3% перекиси бактерий, имеющих каталазу (стафилококки, эшерихии) образуются видимые пузырки из выделяющегося кислорода. Если внести бактерии не имеющих каталазы (стрептококки) пузырьки не образуются.

Каталаза нейтрализует перекись водорода, как эндогенного происхождения, образующейся в результате аэробного окисления, так и экзогенного характера, вырабатываемой клетками иммунной системы хозяина, кроме того, каталаза участвует в окислительном фосфорилировании. Поскольку стафилококки и энтеробактерии продуцируют каталазу, перекись водорода, образующаяся как метаболит при аэробных условиях, для них не токсична.

Автоматизация микробиологических исследований

1. Система контроля стерильности Bact/Alert (гемокультиватор)

Гемокультиваторы предназначены для выделения микроорганизмов из крови и других стерильных жидкостей. Принцип их работы основан на автоматизированном выявлении роста микроорганизмов в образцах крови, помещенных во флакон со специальной средой по индикации образующегося СO₂ с помощью флюоресценции или колориметрически. Использование автоматических систем позволяет повысить чувствительность метода (100 клеток в 1 мл) и гарантирует отсутствие посторонней контаминации микроорганизмами (флакон не открывают в течение всего мониторинга). Работой системы управляет компьютер. Во флакон со средой шприцем вносят исследуемый образец крови. Флакон помещают в индивидуальную ячейку инкубационного блока (в одном блоке 60 ячеек), дальнейший процесс происходит в автоматическом режиме. Флаконы инкубируются на борту аппарата при температуре 37°С, каждые 10-15 минут инкубации проводится автоматическое считывание признаков микробного роста во флаконе (по изменению цвета индикаторного диска на дне флакона). При появлении роста микроорганизмов срабатывает звуковая и световая индикация, флакон извлекают из аппарата для дальнейшей работы – выделения чистой культуры и ее идентификации.

2. Бактериологические анализаторы предназначены для идентификации и определения чувствительности микроорганизмов

1. Анализаторы биохимической активности (учитывают реакции на панелях)
ATB Expression (BioMerieux,Франция) 1991-2012 (снят с производства)	VITEK 2 Compact (BioMerieux,Франция) С 2001 по настоящее время
2. Анализаторы молекулярно-генетического строения генома.	3. Анализаторы масс-спектров белковых молекул
ПЦР - Амплификатор Corbett С 2003 по настоящее время	Масс –спектрограф MALDI Biotyper С 2009 по настоящее время

Схема выделения, индикации и идентификации бактериофага