ЗАНЯТИЕ № 9

ТЕМА: ЭКОЛОГИЯ БАКТЕРИЙ. ИНФЕКЦИЯ. ПАТОГЕННЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ. ТОКСИНЫ МИКРОБОВ. БИОЛОГИЧЕСКИЙ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ) МЕТОД.

ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ ВОПРОСОВ

1. Основные понятия экологической микробиологии (популяция, биотоп, микробиоценоз, экосистема, биосфера). Экологические связи микробов (симбиоз, комменсализм, нейтрализм, конкуренция, паразитизм, хищничество).

2. Микрофлора тела человека. Нормальная (резидентная) микрофлора человека. Аутохтонная и аллохтонная, пристеночная и просветная микрофлора. Формирование и развитие нормальной микрофлоры. Функции нормальной микрофлоры: противоинфекционная, метаболическая, иммунобиологическая, антитоксическая.

3. Дисмикробиоценоз (дисбактериоз), причины, виды, принципы коррекции.

4. Понятие об инфекции. Определение, общая характеристика. Отличия инфекционных болезней от неинфекционных.

5. Роль микроорганизма в инфекционном процессе. Инфицирующая доза. Способы заражения. Входные ворота. Патогенность и вирулентность. Генетический контроль патогенности и вирулентности. Факторы, повышающие и снижающие вирулентность микробов.

6. Факторы патогенности. Методы определения вирулентности, единицы. Облигатно-патогенные и условно-патогенные микроорганизмы.

7. Токсичность и токсигенность микроорганизмов. Эндотоксины, свойства, получение, применение. Экзотоксины, свойства, получение, единицы измерения. Типы экзотоксинов, механизм действия.

8. Роль макроорганизма в развитии и течении инфекционных болезней. Наследственные факторы. Анатомо-физиологическое состояние организма. Роль условий жизни в развитии и течении инфекционных болезней. Природные факторы. Социальные факторы.

9. Классификация инфекционных процессов по тяжести, характеру возбудителя, по источнику инфекции, способу передачи возбудителя и механизму заражения, по распространенности. Классификация инфекционных процессов по локализации микробного очага, длительности течения и кратности заражения.

10. Динамика инфекционного процесса, его особенности.

11. Биологический (экспериментальный) метод исследования, этапы, оценка. Лабораторные животные. Способы заражения.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

1► Изучения нормальной микрофлоры.

А) Посев для изучения нормальной микрофлоры кожи рук на среду Эндо и кровяной агар методом реплик.

Принцип метода: стерильные кусочки фильтровальной бумаги 1х1 см в чашке Петри увлажнить стерильным физ. раствором. Стерильным пинцетом поместить кусочек бумаги на исследуемую поверхность кожи рук на 0,5 мин. Поместить бумагу на поверхность плотной питательной среды (отпечаток) на 1 мин. Бумагу удалить. Чашки с отпечатками инкубировать при 37⁰С, 24-48 часов.

В) Провести учет посева микрофлоры, приготовить препараты из разных типов колоний, окрасить по Граму, микроскопировать (в демонстрационных посевах).

Учет посева микрофлоры:

Биотоп	Кожа
количество и характер колоний на кровяном агаре	36 различных колоний
количество и характер колоний на среде Эндо	12 однотипных колоний
Микроскопия препаратов: Препарат со среды Эндо Окраска по Граму Увеличение 90 х 100	Препарат с кровяного агара Окраска по Граму Увеличение 90 х 100

2► Оценка адгезивности E.coli по их способности к адсорбции на поверхности эритроцитов

Принцип метода: К суспензии эритроцитов добавляют испытуемую культуру микроорганизмов. После инкубации готовят мазки, окрашивают и под микроскопом определяют среднее количество бактерий, адсорбировавшихся на одном эритроците.

Эритроциты в данном случае используются в качестве модели клетки восприимчивого микроорганизма.

Окраска по Романовскому Увеличение 90 х 100 1 - эритроцит 2 - E.coli

3►Определение ферментов инвазивности у стафилококков

1. Плазмокоагулаза

Принцип метода: В пробирку, содержащую цитратную плазму крови кролика, вносится испытуемая культура. После инкубации в термостате учитывается результат. При положительном результате плазма свертывается (коагулирует).

S.aureus	Штамм № 1	Штамм № 2
Результат	плазма свертывается Плазмокоагулаза +	плазма не свертывается Плазмокоагулаза -

2. Фибринолизин

Принцип метода: В пробирку с фибрином (отмытый от эритроцитов сгусток крови) вносят испытуемую культуру. После инкубации в термостате учитывается результат. При положительном результате сгусток растворяется.

S.aureus	Штамм № 1	Штамм № 2
Результат	сгусток растворяется Фибринолизин +	сгусток не растворяется Фибринолизин –

3. Гиалуронидаза

Принцип метода: В пробирку с гиалуроновой кислотой (ГУК) вносят испытуемую культуру. После инкубации в термостате добавляют реактив, вызывающий свертывание ГУК и учитывают результат. При положительном результате (вследствие расщепления ГУК) сгустка не образуется.

S.aureus	Штамм № 1	Штамм № 2
Результат	сгусток не образуется Гиалуронидаза+	сгусток образуется Гиалуронидаза-

4. Лецитовителлаза (лецитиназа)

Принцип метода: выделенные культуры стафилококка засевают на желточно-солевой агар, который содержит 7,5% хлорида натрия и желточную суспензию. При положительном результате вокруг колоний вирулентных стафилококков образуется радужный ореол вследствие расщепления лецитина, содержащегося в желтке куриного яйца.

S.aureus	Штамм № 1	Штамм № 2
Результат	вокруг колоний стафилококков образуется радужный ореол Лецитовителлаза +	вокруг колоний стафилококков нет радужного ореола Лецитовителлаза –

Вывод: (перечислите ферменты вирулентности каждого из двух изученных штаммов)

Штамм № 1 S. аureus вирулентный (плазмокоагулаза+ , фибринолизин+,гиаоуронидаза+, лецитовителлаза+), Штамм № 2 S. аureus не вирулентный (плазмокоагулаза- , фибринолизин-, гиалуронидаза-, лецитовителлаза-).

Бактериальные токсины

Токсичность свойство эндотоксина бактерий вызывать нарушение функций отдельных клеток, органов и тканей макроорганизма

Токсигенность – свойство бактерий продуцировать и выделять во внешнюю среду экзотоксин – белковый яд

Эндотоксинлипополисахаридный комплекс клеточной стенки бактерий, освобождающийся после ее гибели

Эндотоксический шок— это реакция организма на массовое поступление эндотоксина в кровь в результате лизиса клеточных стенок грамотрицательных микроорганизмов, характеризующееся спазмом периферических сосудов, падением артериального давления, острой почечной недостаточностью и возможной смертью в результате снижения содержания кислорода в крови (гипоксии)

Практическое применение эндотоксинов:

1.Эндотоксины – (ЛПС клеточной стенки бактерий) применяются для получения диагностических сывороток, получаемых путем введения ЛПС бактерий лабораторным животным и применяются для идентификации бактерий, а также в качестве диагностикумов для диагностики инфекционных заболеваний (например, сальмонеллезные сыворотки для идентификации сальмонелл возбудителей брюшного тифа, а диагностикумы из сальмонелл для диагностики брюшноготифа).

Экзотоксин –белковый яд продуцируемый и выделяемый бактериями во внешнюю среду

Анатоксин –экзотоксин утративший свои токсические свойства в результате химической и термической обработки

Схема получения экзотоксина и анатоксина.

1. Получение экзотоксина от производственного штамма продуцента ( например для получения дифтерийного экзотоксина используют производственный штамм C. diphtheriae PW-8, который продуцирует токсина в 1000 раз больше чем дикий штамм вызывающий дифтерию.)

2. Выделение и очистка экзотоксина из питательной среды, на которой культивируется производственный штамм – продуцент экзотоксина

3. Обезвреживание экзотоксина формалином (0,3 - 0,8% конечной концентрации) в нейтральной среде при 35 -40°С в течение 3 - 4 нед. В результате получают анатоксин –это токсин утрачивший токсические св-ва, но сохраняющий антигенные и иммуногенные свойства.

4. Очистка анатоксина от балластных веществ, концентрирование и адсорбция на гидроксиде алюминия или др. сорбентах. После проверки полученного препарата на стерильность, безвредность и активность анатоксин используют для иммунизации с целью профилактики инфекционных заболеваний.

Практическое применение анатоксинов:

1. Для получения диагностических и лечебных антитоксических сывороток (путем вакцинации животных анатоксинами) используемых для выявления продукции токсинов микроорганизмами (определение токсигенности или выявления токсинов в продуктах питания и лечения инфекционных заболеваний (например, для лечения дифтерии необходимо прежде всего обезвредить токсин C. diphtheriae, для чего пациенту вводится антитоксическая дифтерийная сыворотка, получаемая путем вакцинации лошадей дифтерийным анатоксином.

2. Для создания вакцин для профилактики инфекционных заболеваний (например, адсорбированный дифтерийно-столбнячный анатоксин в составе АКДС для профилактики дифтерии и столбняка, холероген-анатоксин - в составе холерной вакцины.

Формы инфекции

Моноинфекция–инфекционное заболевание, вызванное одним видом возбудителя, например холера - V. сholerae;

Смешанная (микст-) инфекция―два и более видов возбудителей вызывают инфекционнон заболевание, например раневая инфекция нередко вызвана S. aureus и P.aeruginosae;

Вторичная- ―к первоначальной (основной) инфекции присоединяется другая инфекция, вызываемая условно-патогенным возбудителем. Например вторичная бактериальная пневмония при гриппе;

Реинфекция -повторное заражение тем же возбудителем после выздоровления на фоне несформировавшегося иммунитета. Например, дизентерия .

Суперинфекция -повторное заражение тем же возбудителем на фоне текущего заболевания, например, но устойчивым к антимикробным средствам, первоначально используемых в лечении инфекции .

Рецидив- повторное заболевание за счет эндогенной инфекции (например, при малярии возврат клинических симптомов болезни за счет оставшихся в макроорганизме возбудителей).

Микробоносительство - длительное нахождение микроорганизмов в организме человека без клинических проявлений с выделением их во внешнюю среду, например человек переболевший брюшным тифом может в течении десятков лет выделять возбудителя – S.typhi во внешнюю среду представляя опасность для окружающих.

Персистенция – длительное нахождение микроорганизмов в организме человека без клинических проявлений и без выделения их во внешнюю среду, например вирус герпеса попав в организм циркулирует в нем всю жизнь, активируясь при стрессовых реакциях (переохлаждение, эмоциональные срывы и т.п.).

Периоды развития инфекционного заболевания

1.Инкубационный период-от момента заражения до первых клинических признаков (процесс активного размножения возбудителя).

2.Продромальный период(предвестников) характеризуется общими неспецифическими проявлениями- недомоганием, головной болью, повышением температуры и другими симптомами преимущественно токсического генеза.

3.Период развития (разгара)болезни характеризуется типичными (специфическими) для данной инфекции клиническими проявлениями.

4.Период исхода (реконвалесценция (полное выздоровление); реконвалесцентное микробоносительство;

переход в хроническую форму; летальный исход..

Вопросы

1.Основные понятия экологической микробиологии (популяция, биотоп, микробиоценоз, экосистема, биосфера). Экологические связи микробов (симбиоз, комменсализм, нейтрализм, конкуренция, паразитизм, хищничество).

Экология микроорганизма (экологическая микробиология) - раздел общей микробиологии, изучающий взаимоотношения микроорганизмов между собой, с объектами внешней среды и с макроорганизмом.

Биосфе́ра (от греч. βιος — жизнь и σφαῖρα — сфера, шар) — оболочка Земли, заселённая живыми организмами, находящаяся под их воздействием и занятая продуктами их жизнедеятельности; «пленка жизни»; глобальная экосистема Земли.

Термин введён Жаном-Батистом Ламарком в начале XIX в., а учение о биосфере создал русский биогеохимик и философ В. И. Вернадский. Он впервые отвёл живым организмам роль главнейшей преобразующей силы планеты Земля, учитывая их деятельность не только в настоящее время, но и в прошлом. Верхняя граница в атмосфере: 15-20 км. Она определяется озоновым слоем, задерживающим коротковолновое УФ-излучение, губительное для живых организмов. Нижняя граница в литосфере: 3,5-7,5 км. Она определяется температурой перехода воды в пар и температурой денатурации белков, однако в основном распространение живых организмов ограничивается вглубь несколькими метрами. Нижняя граница в гидросфере: 10-11 км. Она определяется дном Мирового Океана, включая донные отложения.

Биосферу слагают следующие типы веществ^[2]: Живое вещество — вся совокупность тел живых организмов, населяющих Землю, общей массой 2,4-3,6·10¹² т (в сухом весе),что составляет менее 10⁻⁶ массы других оболочек Земли. Однако, это одна «из самых могущественных геохимических сил нашей планеты», поскольку живое вещество не просто населяет биосферу, а преобразует облик Земли. Биогенное вещество — вещество, создаваемое и перерабатываемое живым веществом. На протяжении органической эволюции живые организмы тысячекратно пропустили через свои органы, ткани, клетки, кровь всю атмосферу, весь объём мирового океана, огромную массу минеральных веществ. Эту геологическую роль живого вещества можно представить себе по месторождениям угля, нефти, карбонатных пород и т. д. Нефть — результат литогенеза. Она представляет собой жидкую (в своей основе) гидрофобную фазу продуктов фоссилизации (захоронения) органического вещества (керогена) в водно-осадочных отложениях.Косное вещество — в образовании которого жизнь не участвует; твердое, жидкое и газообразное. Биокосное вещество, которое создается одновременно живыми организмами и косными процессами, представляя динамически равновесные системы тех и других. Таковы почва, ил, кора выветривания и т. д. Организмы в них играют ведущую роль.

Жизнь на Земле зародилась примерно 3,5 млрд лет назад. Такой возраст имеют найденные палеонтологами древнейшие органические остатки. Возраст Земли как самостоятельной планеты Солнечной системы оценивается в 4,5 млрд лет. Таким образом, можно считать, что жизнь зародилась ещё в юношескую стадию жизни планеты. В архее появляются первые эукариоты — одноклеточные водоросли и простейшие. Начался процесс почвообразования на суше. В конце архея появился половой процесс и многоклеточность у животных организмов.

Биотоп - территориально ограниченный участок биосферы с относительно однородными условиями жизни.

Популяция -совокупность особей одного вида, обитающих в пределах определенного биотопа.

Биоценоз -сообщество популяций организмов, обитающих в определенном биотопе.

Экосистема - система, состоящая из биотопа и биоценоза.

Биосфера - общая сумма всех экосистем.

Микробиоценоз сообщество популяций микроорганизмов, обитающих в определенном биотопе(например микробиоценоз кожи сообщество популяций микроорганизмов обитающих на поверхности кожи).

Естественными средами обитания большей части организмов являются вода, почва и воздух. В зонах обитания микроорганизмы образуют микробиоценозы – сообщества со специфическими и часто необычными взаимоотношениями. Каждое микробное сообщество в конкретном ценозе образуют специфичные аутохтонные (резидентные ) микроорганизмы, обычно в них встречающиеся. В природных биоценозах (почва, вода, воздух) выживают и размножаются лишь те микроорганизмы, которым благоприятствует окружающая среда; их рост прекращается, как только условия окружающей среды меняются.

Экологические связи в микробиоценозах.

Нейтрализм – обитающие в одном биотопе популяции не оказывают друг на друга ни стимулирующего, ни подавляющего действия.

Конкуренция (антагонизм) – подавление одной популяции другой.

Хищничество – одна популяция, существует за счет другой популяции.

Симбиоз – обе популяции извлекают для себя пользу. Несколько проявлений симбиотических взаимоотношений:

• мутуализм ― оба сожителя не причиняют вреда друг другу, а наоборот приносят пользу (например, клубеньковые бактерии и бобовые растения); это взаимовыгодное сожительство;

• комменсализм (нахлебничество) ― один из сожителей живет за счет другого, но не приносит ему вреда (например, нормальная микрофлора всех естественных биотопов организма человека);

2.Микрофлора тела человека. Нормальная (резидентная) микрофлора человека. Аутохтонная и аллохтонная, пристеночная и просветная микрофлора. Формирование и развитие нормальной микрофлоры. Функции нормальной микрофлоры: противоинфекционная, метаболическая, иммунобиологическая, антитоксическая.

В организме человека обитают примерно 500 видов микроорганизмов, составляющих его нормальную микрофлору. Макроорганизм и его микрофлора в нормальных условиях находятся в состоянии динамического равновесия (эубиоза), которое сложилось в процессе эволюции.

Открытыми биологическими системами (биотопами), которые сообщаются с внешней средой, являются - кожа, расположенные до голосовой щели отделы респираторного тракта, ротовая полость, желудочно-кишечный тракт, слизистые оболочки газа, передней уретры, вагина. Они заселяются микроорганизмами, среди которых доминируют бактерии. Простейшие и вирусы представлены значительно меньшим числом видов.

В норме от микроорганизмов свободны - кровь, ликвор, синовиальная жидкость, костный мозг, брюшная полость, плевральная полость, матка.

Естественную микрофлору любых биотопов подразделяют на резидентную (аутохтонную или постоянную) и транзиторную (аллохтонную или случайную).

Если постоянная микрофлора содержит представителей, специфичных для данного биотопа, то случайная состоит из особей, занесенных извне. Так, в желудочно-кишечном тракте могут оказаться посторонние микроорганизмы, попавшие с пищей или напитками. Кожные покровы наиболее часто контаминируются случайной микрофлорой из окружающей среды. В трахее, бронхах, легких, пищеводе также может обнаруживаться транзиторная микрофлора.

Постоянная микрофлора конкретного биотопа относительно стабильна по составу. Вместе с тем состав и физиологическая роль составляющих ее микроорганизмов далеко не равнозначны. Поэтому в постоянной микрофлоре различают две фракции: облигатную и факультативную.

Облигатная микрофлора является главной составляющей любого микробиоценоза, она противодействует заселению биотопа случайными микроорганизмами, участвует в процессах ферментации, иммуностимуляции, т.е. выполняет защитную и ряд других физиологических функций.

Факультативная микрофлора составляет меньшую часть постоянных обитателей биотопа. Если постоянная микрофлора проявляет себя преимущественно бродильной активностью (т.е. расщеплением углеводов с образованием кислых продуктов), то факультативная фракция весьма активно участвует в гнилостных процессах (распаде белковых веществ с образованием щелочных продуктов).