2► 2 Этап бактериологического метода исследования (выделение чистой культуры):

А) Изучение изолированных колоний (эшерихий, стафилококка) на пластинчатом МПА.

Изучаемые культуральные свойства	1 тип колоний	2 тип колоний
- форма колонии	Правильной формы, круглые	Правильной формы
- консистенция	однородные	однородные
- размер колонии	средние (размером 2-4 мм)	Крупные,
- цвет	белые	серые
- характер края	с ровными краями	с ровными краями
- характер поверхности	выпуклые	плоские

Б) Приготовление мазков из отобранных колоний (окраска по Граму).

2. Морфология микроорганизмов из изолированных колоний (окраска по Граму) Мазок колонии 1 типа Окраска по Граму Увеличение 7х90=630 раз Мазок колонии 2 типа Окраска по Граму Увеличение 7х90=630 раз

В) Пересев изолированных колоний на скошенный МПА для накопления чистой культуры.

3►Выделение чистой культуры анаэробных бактерий: посев суспензии почвы на среду Китта-Тароцци для выделения патогенных клостридий

Среда Китт— Тароцци состоит из питательного бульона, 0,5% глюкозы и кусочков печени или мясного фарша для поглощения кислорода из среды. Перед посевом среду прогревают на кипящей водяной бане в течение 20 — 30 минут для удаления воздуха из среды. После посева питательную среду сразу заливают слоем парафина или вазелинового масла для изоляции от доступа кислорода.

Методы создания анаэробиоза:

1.Физический- откачивание воздуха, введение специальной газовой безкислородной смеси (чаще- N₂- 85%, CO₂- 10%, H₂- 5%), предварительное кипячение питательных сред, посев в глубокий столбик агара, заливка сред вазелиновым маслом для сокращения доступа кислорода, использование герметически закрывающихся флаконов и пробирок, шприцев и лабораторной посуды с инертным газом, использование плотно закрывающихся эксикаторов с горящей свечой

2.Химический- применяют химические поглотители кислорода.

3.Биологический - совместное культивирование строгих аэробов и анаэробов (аэробы поглощают кислород и создают условия для размножения анаэробов – метод Фортнера).

Среда Китт — Тароцци состоит из питательного бульона, 0,5 % глюкозы и кусочков печени или мясного фарша для поглощения кислорода из среды. Перед посевом среду прогревают на кипящей водяной бане в течение 20 — 30 минут для удаления воздуха из среды. После посева питательную среду сразу заливают слоем парафина или вазелинового масла для изоляции от доступа кислорода.

4.Смешанный- используют несколько разных подходов.

Используются специальные приборы для создания анаэробных условий - анаэростаты. В настоящее время наиболее простым и эффективным оборудованием для создания анаэробных и микроаэрофильных условий является химический метод со специальными пакетами, действующими по принципу поглощения атмосферного кислорода в герметически закрытых емкостях.

Среда Вильсона-Блера (пробирки,чашки):

Питательная основа МПА Дыхательный субстрат глюкоза

Редуцирующий фактор сульфит натрия и двуххлористое железо сульфит-натрия Na₂SO_{3 →}Na₂S

Для среды Вильсона — Блера базой является агар с добавлением глюкозы, Клостридии образуют на этой среде колонии чёрного цвета за счет восстановления сульфита до сульфид — аниона, который соединяясь с катионами железа (II) дает соль чёрного цвета. Как правило, черные на этой среде образования колонии, появляются в глубине агарового столбика.

Тиогликолевая среда (среда для контроля стерильности): (пробирки):

Питательная основа МПБ Дыхательный субстрат глюкоза Редуцирующий фактор тиогликолят натрия

Индикатор резазурин

Глюкозо-кровяной агар Цейсслера: (чашки): Питательная основа МПА, кровь

Дыхательный субстрат глюкоза Редуцирующий фактор гемоглобин

Термин «анаэробы» ввел Луи Пастер, открывший в 1861 году бактерии маслянокислого брожения.

А Лекция 3 Физиология микроорганизмов. Метаболизм бактерий.

Физиология микроорганизмов включает:

• типы питания;

• типы дыхания;

• культивирование (условия, среды, характер и скорость роста);

• биохимическую активность;

• изменчивость;

• выделение биологически активных веществ, токсинов и других факторов патогенности;

• чувствительность к антибиотикам, бактериофагам, бактериоцинам;

• другие биологические свойства.

Метаболизм бактерий – совокупность физико-химических процессов (химических превращений и реакций), направленных на воспроизводство структур и обеспечение жизненных функций микробной клетки, таких как:

1. рост и размножение;

2. отложение резервного пищевого материала;

3. транспорт питательных веществ в микробную клетку;

4. выделение продуктов метаболизма (токсинов, ферментов, антибиотиков и других биологически активных веществ);

5. движение;

6. спорообразование;

7. адгезия на чувствительных рецепторах клеток хозяина и проникновение в них;

8. различных адаптивных реакций на изменение внешней среды.

Анаболизм — совокупность биохимических реакций, осуществляющих синтез компонентов клетки.

Катаболизм — совокупность реакций, обеспечивающих клетку энергией.

Схема изучения метаболизма – этапы:

1. Начальный (периферический) метаболизм – проникновение веществ в клетку извне и распад до промежуточных продуктов.

2. Амфиболизм (промежуточный метаболизм) – образование промежуточных продуктов метаболизма, общих для катаболических и анаболических путей.

3. Конечные, строго специализированные этапы конструктивного метаболизма (ведут к построению структур клетки) и энергетического метаболизма (образование АТФ).

Механизмы проникновения питательных веществ в клетку:

1. Простая диффузия (для истинных растворов). Энергонезависимый процесс.

2. Облегченная диффузия («паром по течению») – в направлении градиента концентрации с участием белков – переносчиков. Энергозависимый процесс.

3. Активный транспорт – против концентрационного и электрохимического градиента с участием пермеаз (амино-, оксикислотных, ионных и др.). Процесс идет с затратой энергии АТФ, зависит от заряда веществ и их трансформации в процессе переноса.

Микроорганизмы по способности усваивать источники углерода делятся на две группы: автотрофы (лат. autos — сам, trophe — питание) синтезируют все углеродсодержащие компоненты клетки из СО₂ как единственного источника углерода и гетеротрофы (лат. heteros — другой, «питающийся за счет других») используют разнообразные органические углеродсодержащие соединения.

В зависимости от источников энергии и микроорганизмы подразделяют на фототрофы (фотосинтезирующие), способные использовать солнечную энергию, и хемотрофы (хемосинтезирующие), получающие энергию за счет окислительно-восстановительных реакций.

В зависимости от используемых доноров электронов бактерии разделяют на литотрофы (используют неорганические доноры электронов) и органотрофы (используют органические соединения).

Прототрофы - микроорганизмы, способные синтезировать все необходимые им органические соединения из глюкозы и солей аммония.

Ауксотрофы - микроорганизмы, не способные синтезировать какие-либо органические соединения. Они получают эти соединения в готовом виде из окружающей среды или организма человека.

Ферменты (от греч.fermentum-закваска ) -высокоспецифические белковые катализаторы, присутствующие во всех живых клетках, без которых не возможны жизнь и размножение. Ферменты распознают соответствующие им метаболиты (субстраты), вступают с ними во взаимодействие и ускоряют химические реакции. Ферменты являются белками.

Ферментный состав микроорганизма определяется геномом и является достаточно стабильным признаком. Определение ферментов широко применяется для биохимической идентификации бактерий.

Эндоферменты катализируют метаболизм проходящий внутри клетки.

Экзоферменты выделяются клеткой в окружающую среду.

Конститутивные ферменты постоянно синтезируются в определенных концентрациях.

Индуцибельные ферменты – это ферменты, концентрация которых увеличивается при поступлении соответствующего субстрата.

Ферменты агрессии: гиалуронидаза, фибринолизин, нейраминидаза, коллагеназа, лецитиназа (лицитовителлаза), коагулаза, уреаза, аминокислотные декарбоксилазы, дезоксирибонуклеаза.

Культивирование – получение культур микроорганизмов в условиях искусственной питательной среды.

Цели культивирования:

1. получение чистых культур патогенных микроорганизмов и их идентификация;

2. накопление биомассы продуцентов БАВ (витаминов, гормонов, аминокислот, антибиотиков и др.);

3. получение диагностических и профилактических препаратов (вакцин, диагностикумов);

4. хранение эталонных музейных культур;

5. в санитарной микробиологии для определения санитарно-показательных микроорганизмов – индикаторов загрязненности окружающей среды.

Культура – популяция микроорганизмов, выращенная на питательной среде.

Чистая культура – популяция одного вида микроорганизмов, выращенная из изолированной колонии на питательной среде.

Большинство патогенных микробов выращивают на питательных средах при температуре 37°С в течение 1-2 сут.

Классификация питательных сред

По консистенции: жидкие, полужидкие, плотные.

По происхождению: естественные (молоко, картофель), искусственные, полусинтетические, синтетические

По составу: простые (МПА, МПБ, овощи, молоко), сложные (1% глюкозы, 10-20% сыворотки крови, 20-30% асцитической жидкости,5-10% дефибринированной крови).

По назначению:

1. универсальные — среды, на которых хорошо растут многие виды бактерий. К ним относятся мясо-пептонный бульон (МПБ) и мясо-пептонный агар (МПА);

2. специальные - среды, специально приготовленные для получения роста бактерий, которые не растут на универсальных средах;

3. дифференциально-диагностические - среды, позволяющие отличать одни виды бактерий от других по ферментативной активности;

4. селективные — среды, содержащие вещества, используемые микроорганизмами определенных видов и препятствующие росту других микроорганизмов. Селективные среды позволяют направленно отбирать из исследуемого материала определенные виды бактерий;

5. дифференциально-селективные — среды, сочетающие в себе свойства дифференциально-диагностических и селективных сред;

6. консервирующие;

7. обогатительные.