1) Куриный эмбрион (кэ)
Обозначьте на рис. структурные элементы КЭ:
а) хорионаллантоисная оболочка (за скорлупой);
б) аллантоисная полость (игла в ней ;
в) амнион (вокруг эмбриона);
г) желточный мешок (напротив эмбриона).
|
Методы заражения куриных эмбрионов:
|
Материал вводят, вскрывая или не вскрывая скорлупу, в желточный мешок, на ХАО, в аллантоисную, амниотическую полости, тело эмбриона или эмбриону внутривенно.
|
|
Феномены, позволяющие выявить вирус в курином эмбрионе: |
1.Недоразвитие или 2. Гибель ( выявляются при овоскопии). 3.Изменение оболочек (вирусы оспы, герпеса). 4.Обнаружение включений вирусов в световом, электронном микроскопах, антигенов в ИЭМ, РИФ и др. 5.РГА с амниотической, аллантоисной жидкостью. |
РГА с аллантоисной жидкостью куриных эмбрионов, зараженных вирусом гриппа
Принцип метода способность вируса гриппа (тропизм) агглютинировать эритоциты кур
Исследуемый материал вирусосодержащий материал (амниотичекая или аллантоисная жидкость)
Дополнительные ингредиенты реакции 1% суспензия отмытых эритроцитов кур
|
Разведение вируса |
1/2 |
1/4 |
1/8 |
1/16 |
1/32 |
1/64 |
Контроль эритроцитов |
|
1 кап. взвеси КЭ | |||||||
|
Результат |
|
|
|
|
|
|
|
Вывод: положительная РГА указывает на присутствие (индикация) вируса гриппа в исследуемом материале
2) Культура клеток
|
Первичные культуры клеток |
Перевиваемые культуры клеток |
|
Это клетки различного типа (почек обезьян, почек эмбриона человека, амниона человека, куриных эмбрионов). Срок жизни таких культур ограничен ≤ 10 пересевами. Лишь отдельные группы клеток первичных культур могут сохранить способность к росту и размножению и при многократных пересевах они дают начало перевиваемым культурам клеток. |
Перевиваемые клеточные линиии характеризуются потенциальным бессмертием и гетероплоидным набором хромосом. Наиболее часто применяются такие линии перевиваемых клеток как RH - из почки человека; ВНК-21 - из почек однодневных сирийских хомяков; ПМС - из почки морской свинки, Vero – из почек зеленой мартышки и др. Полуперевиваемые культуры клеток (диплоидные) - клетки одного типа, способные in vitro выдерживать максимум 50 пассажей, сохраняя при этом свою исходную морфологию и диплоидный набор хромосом. |
Питательные среды и солевые растворы для культур
- Буферные солевые растворы применяются для промывки тканей и клеток в процессе приготовления клеточных культур и для приготовления питательных сред.
- Питательные среды по своему назначению делятся на ростовые и поддерживающие.
Широкое применение находят синтетические стандартные питательные среды, например, синтетическая среда 199 и среда Игла. Независимо от назначения все питательные среды для культур клеток конструируются на основе сбалансированного солевого раствора. Чаще всего им является раствор Хенкса. В состав ростовых сред входит сыворотка крови животных.
Выделение вирусов и методы их индикации в культуре клеток
Для заражения используются чувствительные к данному вирусу культуры с хорошо развитым монослоем клеток, находящиеся в пробирках (флаконах).
Перед заражением клеток питательную среду удаляют и в каждую пробирку (лунку планшета или флакон) вносят по 0,1-0,2мл взвеси испытуемого материала, предварительно обработанного антибиотиками. После 30 - 60 мин. контакта вируса с клетками удаляют избыток материала, вносят по 1,0 - 1,5мл на пробирку поддерживающей среды и оставляют в термостате до выявления признаков репродукции вирусов.
ФЕНОМЕНЫ, ПОЗВОЛЯЮЩИЕ ВЫЯВИТЬ ВИРУС В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК
1. Цитопатический эффект (действие) – (ЦПЭ или ЦПД), который является следствием поражения клеток под действием размножающегося в них вируса.
ЦПД может быть трех основных типов:
а) кругло- или мелкоклеточная дегенерация;
б) образование гигантских многоядерных клеток - симпластообразование;
в) образование внутриядерных или цитоплазматических включений вирусспецифических или неспецифических.