1. Физиология крови

Работа 1.1. МЕТОДИКА ЗАБОРА КРОВИ ИЗ ПАЛЬЦА

При заборе крови следует помнить о возможной ее инфицированности вирусом СПИДа, гепатита В и связанным с этим повышенным риском заражения, которому подвергаются лаборанты, проводящие серологические и клинические исследования. Поэтому при проведении анализа крови нужно руководствоваться правилами о профилактике СПИДа у медицинского персонала, занятого забором крови и ее исследованием.

Ц е л ь р а б о т ы: освоить методику получения крови из пальца.

Д л я р а б о т ы н е о б х о д и м ы: стерильный скарификатор, спирт, вата, йод, эфир. Объект исследования - человек.

Х о д р а б о т ы

1. Пациент должен сидеть напротив проводящего забор крови, рука (лучше левая) находится на столе.

2. Забор крови осуществляют из 4-го пальца, т.к. синовиальное влагалище его изолировано, что предотвращает распространение воспалительного процесса в случае его возникновения на кисть.

3. Кожа пальца дезинфицируется и обезжиривается спирт-эфиром.

4. Скарификатор берут пинцетом из стерилизатора за середину, а затем рукой за конец, противоположный колющему, подняв скарификатор острием вверх, чтобы капля воды не стекала на режущий край. Лучше пользоваться одноразовыми скарификаторами.

5. Прокол кожи делают в подушечке пальца в центральной точке, скарификатор погружают на всю глубину режущей поверхности.

6. Первую каплю крови снимают сухой ватой, тщательно вытирают палец (кожа должна быть сухой).

7. Следующая капля крови должна иметь выпуклый мениск и не растекаться по пальцу, из этой и последующей капель кровь берется для анализа.

8. После забора крови место укола обрабатывается спиртом или настойкой йода.

Работа 1.2. МЕТОДИКА ЗАБОРА КРОВИ ИЗ ВЕНЫ УХА У КРОЛИКА

Необходимость в заборе крови из уха кролика возникает при проведении ряда биохимических, физиологических, иммунологических и других исследований.

Ц е л ь р а б о т ы: освоить методику забора крови из уха кролика.

Д л я р а б о т ы н е о б х о д и м ы: стерильная инъекционная игла, ножницы или бритва, вата, спирт, эфир, йод, гепарин. Объект исследования - кролик.

Х о д р а б о т ы

Забор крови у кролика проводят из краевой вены. Кролика необходимо предварительно напоить водой за 1,5 - 2,5 часа до взятия крови.

Выстричь ножницами или выбрить бритвой шерсть на краю уха. Через кожу хорошо видна краевая вена. Для дезинфекции и обезжиривания обработать спирт-эфиром кожу уха в месте прокола вены. Промыть стерильную иглу для инъекций раствором гепарина. Зажать пальцами центральный конец вены, сделать прокол и расположить иглу в просвете вены острием по направлению к периферии (в направлении притока крови).

Кровь собрать в пробирку в количестве 2-4 мл (не более 70 мл за 1 раз). Область прокола необходимо после забора крови зажать ватным тампоном до прекращения кровотечения из вены.

Кровь также можно получить путем прокола вены иглой и собирания вытекающей на поверхность кожи крови в пробирку.

Работа 1.3. СВЕЖИЙ ПРЕПАРАТ КРОВИ ПОД МИКРОСКОПОМ

Кровь состоит из жидкой части - плазмы и взвешенных в ней клеток (форменных элементов): эритроцитов (красных кровяных телец), лейкоцитов (белых кровяных телец) и тромбоцитов (кровяных пластинок).

Ц е л ь р а б о т ы: изучить особенности свежего препарата крови.

Д л я р а б о т ы н е о б х о д и м ы: капля свежей крови, микроскоп, предметные и покровные стекла, стерильный скарификатор, вата, спирт, эфир, йод.

Х о д р а б о т ы

Для рассмотрения эритроцитов под микроскопом каплю крови поместить на предметное стекло, накрыть покровным, выбрать поле для наблюдения с нетолстым слоем крови. Поле зрения занимают эритроциты, расположенные чаще всего в виде "монетных столбиков" . Сделать рисунок, оформить вывод о закономерности расположения эритроцитов в свежем препарате крови.

Работа 1.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕМАТОКРИТА

Гематокритом называют выраженное в процентах отношение объема форменных элементов к объему цельной крови.

Существует несколько методик определения гематокрита. Все они основаны на центрифугировании предотвращенной от свертывания крови, набранной в капилляр и измерении столбиков крови и осевших эритроцитов. Настоящий вариант метода определения гематокрита разработан на кафедре нормальной физиологии МГМИ.

Ц е л ь р а б о т ы: освоить методику определения гематокрита и определить его величину в исследуемой крови.

Д л я р а б о т ы н е о б х о д и м ы: гибкая полиэтиленовая трубочка, центрифуга, раствор гепарина в разведении 1:10 в 0,9 % NaCI, инъекционные иглы, шприц, вата, спирт, йод. Объект исследования - человек.

Х о д р а б о т ы

Перед забором крови гибкую полиэтиленовую трубочку промыть раствором гепарина. При помощи шприца набрать в трубочку кровь без пузырьков на 2/3 ее длины. Перегнуть трубочку посередине и поместить в узкую пробирку открытыми концами вверх. Центрифугировать 20 минут при 3000 об/мин. После центрифугирования измерить линейкой столбик набранной крови в выпрямленной трубочке и измерить столбик эритроцитов в мм, вычислить процентное соотношение. За 100 % принять длину столбика всей набранной крови, за Х - длину столбика эритроцитов, тогда найденное значение Х % будет соответствовать показателю гематокрита крови. Для перевода гематокрита, выраженного в % в единицы системы СИ полученную величину умножить на 0,01.

В выводе сравнить полученный показатель гематокрита с нормой.

Работа 1.5. ПОЛУЧЕНИЕ СЫВОРОТКИ КРОВИ

Сыворотка крови представляет собой плазму, лишенную фибриногена. Ее получение используется довольно широко при выполнении многих физиологических, биохимических, иммунологичеких, иммуносерологических и других исследований.

Ц е л ь р а б о т ы: освоить методику и получить сыворотку крови.

Д л я р а б о т ы н е о б х о д и м ы: пробирки, пастеровские пипетки, центрифуга, цельная кровь, вата, спирт, стерильная инъекционная игла, йод, эфир. Объект исследования- кролик.

Х о д р а б о т ы

Свежую кровь собрать в пробирку и выдержать 10-15 мин в теплом месте до ее свертывания, после чего произвести "обведение" пастеровской пипеткой, между стенкой пробирки и краем поверхностной пленки крови т.е. отслоение образующихся сгустков от стенок пробирки. Центрифугировать кровь в пробирке 20 мин при 1000 об/мин. По окончании центрифугирования рассмотреть и описать содержимое.

Объяснить отличие сыворотки от цельной крови и ее плазмы.

Работа 1.6. ПОЛУЧЕНИЕ ПЛАЗМЫ, СЫВОРОТКИ, ДЕФИБРИНИРОВАННОЙ КРОВИ И ФИБРИНА

Кровь состоит из жидкой части - плазмы и взвешенных в ней форменных элементов - эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов.

Ц е л ь р а б о т ы: освоить методику раздельного получения плазмы, сыворотки, дефибринированной крови и фибрина.

Д л я р а б о т ы н е о б х о д и м ы: мерная посуда на 10, 20 и 50 мл, пробирки химические и центрифужные, центрифуга, стеклянные шарики, лимоннокислый натрий (цитрат натрия) в виде 4 % раствора, стерильная инъекционная игла, вата, спирт, йод, эфир. Объект исследования - кролик.

Х о д р а б о т ы

а) Получение плазмы. Для получения плазмы кровь необходимо предохранить от свертывания путем тщательного перемешивания 5 мл свежей крови с 0,2 мл раствора цитрата натрия, не допуская вспенивания. Полученная таким образом кровь после длительного стояния или центрифугирования (3000 об/мин в течение 20 мин) разделятся на плазму (верхний слой) и форменные элементы.

б) Получение сыворотки. Для получения сыворотки 5 мл свежей крови в пробирке поместить в термостат при 37,0 ⁰С на 20-30 мин. Отслаивание образующегося фибрина от стенок пробирки производят "обведением" пастеровской пипеткой. Уравновесить пробирки и центрифугировать 20 мин при 1000 об/мин.

Сыворотка представляет собой прозрачную, желтоватого цвета жидкость. Она находится после цетрифугирования в верхней части пробирки над осевшим на дно сгустком.

в) Получение дефибринированной крови и фибрина. Кровь, содержащая все составные части, за исключением белка фибриногена, называется дефибринированной.

Для получения дефибринированной крови необходимо в колбочку с 5-10 мл свежей крови положить несколько стеклянных шариков. В течение 10-15 мин размешивать кровь вращательными движениями.

Фибриноген, выпадающий в виде нитей фибрина, оседает на стеклянных шариках. Оставшаяся часть крови содержит сыворотку и форменные элементы. Это и есть дефибринированная кровь. Кровь профильтровать через марлю. Осевший на шариках фибрин отмыть в воде.

В выводе отметить различия плазмы, сыворотки крови, дефибринированной крови, описать полученный фибрин.

Работа 1.7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОТНОСИТЕЛЬНОЙ ПЛОТНОСТИ КРОВИ

Ц е л ь р а б о т ы: освоить методику определения относительной плотности исследуемой крови и определить ее величину в исследуемом образце.

Д л я р а б о т ы н е о б х о д и м ы: пробирки, пипетки, растворы хлороформа в бензоле с относительной плотностью 1,060; 1,050; 1,040 и 1,030, вата, спирт, йод, эфир, стерильный скарификатор. Объект исследования - человек.

Х о д р а б о т ы

В 4 пробирки внести по 5-6 мл раствора хлороформа в бензоле с относительной плотностью 1,060; 1,050; 1,040 и 1.030. Пипеткой выпустить по капле свежей крови, полученной из пальца, в средние слои растворов. Наблюдать за движением капель (вверх, вниз, без движения). Относительная плотность крови соответствует относительной плотности раствора, в котором капля не всплывает и не тонет.

Полученные результаты сравнить с нормой.

Работа 1.8. ПОДСЧЕТ КОЛИЧЕСТВА ЭРИТРОЦИТОВ

Ц е л ь р а б о т ы: освоить методику и определить количество эритроцитов в исследуемой крови.

Д л я р а б о т ы н е о б х о д и м ы: микроскоп, счетная камера Горяева, меланжер для эритроцитов, 3 % раствор хлорида натрия, покровные стекла, регулируемая пипетка, пробирки, стерильный скарификатор, вата, спирт, эфир, йод. Объект исследования - человек.

Х о д р а б о т ы

Необходимо перед началом работы рассмотреть счетную камеру под микроскопом, найти малые квадратики и большие квадраты сетки (рис.1). Камеру предварительно необходимо подготовить путем притирания покровного стеклышка к боковым выступающим граням камеры до появления цветных (ньютоновских) колец. В каплю свежей крови, полученной из пальца, погрузить кончик меланжера (с красной бусинкой в расширении) для эритроцитов и набрать кровь до метки 0,5, следя, чтобы в капилляр не

попали пузырьки воздуха. Быстро, пока кровь не свернулась, перенести кончик меланжера в 3 % раствор хлорида натрия и набрать его до метки 101, т.е. развести кровь в 200 раз. После этого взять заполненный меланжер (смеситель), зажать его концы 1 и 3 пальцами и в течение 1 мин встряхи-

вать. После тщательного перемешивания крови, удалив предварительно 1-2 капли, нанести небольшую капельку на сетку камеры.

При необходимости такое же разведение может быть выполнено другим способом. Например, 0,02 мл крови смешать с 4 мл 3 % NaCl в пробирке. Содержимое пробирки в этом случае тщательно перемешивается.

Рис. 1. Приборы для подсчета форменных элементов крови. Слева - счетная камера Горяева (а - вид сверху, б - вид сбоку). Справа - смесители для подсчета эритроцитов (в) и лейкоцитов (г), сетка счетной камеры (д).

Если капля разведенной крови будет слишком велика, то жидкость может попасть на боковые грани камеры и высота слоя над сеткой будет больше 0,1 мм. В этом случае камеру следует промыть дистиллированной водой, насухо вытереть и заполнить снова. Разведенную (в меланжере) кровь следует еще раз перемешать.

Заполнив камеру, поместить ее под микроскоп и, если форменные элементы расположены равномерно (что является показателем хорошего перемешивания крови), приступить к подсчету. Считать эритроциты удобнее при большом увеличении.

Необходимо подсчитать число эритроцитов в 5 больших квадратах, расположенных в разных местах сетки, например, по диагонали. Во избежание двухкратного подсчета клеток, лежащих на границе между малыми квадратиками, руководствоваться правилом Егорова, согласно которому, относящимися к данному квадратику считаются эритроциты, лежащие как внутри квадратика, так и на его левой и верхней границе. Эритроциты, лежащие на правой и нижней границе для данного квадратика не учитываются.

Формула для вычисления количества эритроцитов в 1 мм³ крови:

А х 4000 х 200

N = ————————, где:

80

N - искомое число эритроцитов;

А - число эритроцитов в 80 маленьких квадратиках (или в 5 больших);

4000 - множитель для получения содержания эритроцитов в одном мм³ крови;

200 - степень разведения эритроцитов.

Для перевода полученного количества эритроцитов в единицы СИ, подсчитанное количество эритроцитов умножить на 10⁶ и выразить в N х 10¹² /л (тера на литр). Зарисовать фрагмент сетки камеры Горяева с маленькими и большими квадратами.

В выводе сравнить количество подсчитанных эритроцитов с нормой.

Работа 1.9. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА ГЕМОГЛОБИНА

В КРОВИ ПО СПОСОБУ САЛИ

Определение содержания гемоглобина в крови производится колориметрическими способами, один из которых (гематиновый метод Сали) основан на образовании устойчивого раствора коричневого цвета при взаимодействии гемоглобина с соляной кислотой. Принцип колориметрического способа заключается в том, что если исследуемый раствор путем разбавления довести до окраски, одинаковой со стандартным раствором, то концентрация растворенных веществ в обоих растворах будет одинакова, а количества веществ будут соотносится как их объемы. В стандартном растворе гемоглобина содержится 167 г/л.

Ц е л ь р а б о т ы: освоить методику определения гемоглобина и найти содержание гемоглобина в исследуемой крови.

Д л я р а б о т ы н е о б х о д и м ы: гемометр Сали, капилляр с меткой 0,02 мл, 0,1 н раствор соляной кислоты, дистиллированная вода, свежая кровь, пипетка, стеклянная палочка, стерильная инъекционная игла, вата, спирт, йод, эфир, стерильный скарификатор. Объект исследования - человек.

Х о д р а б о т ы

В среднюю пробирку гемометра налить 0,1 н раствор соляной

Рис.2. Гемометр Сали и капилляр. (Пояснение в тексте)

кислоты до нижней кольцевой метки. Из пальца обычным способом на -

брать в капилляр (рис.2) кровь без пузырьков до метки. Излишек крови

можно удалить из капилляра прикладыванием ваты или фильтровальной

бумаги к кончику капилляра. Выдуть кровь на дно пробирки из капилляра так, чтобы верхний слой кислоты остался неокрашенным. Не вынимая капилляр, промыть его раствором соляной кислоты из верхнего слоя пробирки гемометра. После этого содержимое пробирки перемешать стеклянной палочкой и поставить в гемометр на 5-10 мин. Это время необходимо для полного превращения гемоглобина в солянокислый гематин

Затем к содержимому пробирки прибавить по каплям дистиллированную воду, каждый раз перемешивая раствор стеклянной палочкой до тех пор, пока цвет полученного раствора не станет одинаковым с цветом стандартного раствора боковых ампул гемометра. Цифра, стоящая на уровне нижней границы мениска полученного раствора отражает содержание гемоглобина в исследуемой крови в грамм-процентах (г%).

Перевод полученных данных в единицы системы СИ (в г/л) производят путем умножения измеренного количества гемоглобина в г% на 10. Зарисовать гемометр и капилляр.

В выводе сравнить с нормой полученное содержание гемоглобина в исследуемой крови.

Работа 1.10. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕМОГЛОБИНА КРОВИ ГЕМОГЛОБИН-

ЦИАНИДНЫМ (ФОТОЭЛЕКТРОКОЛОРИМЕТРИЧЕСКИМ)

МЕТОДОМ

Ц е л ь р а б о т ы: освоить методику определения гемоглобина крови гемоглобинционидным методом и определить содержание гемоглобина в исследуемой крови.

Д л я р а б о т ы н е о б х о д и м ы: фотоколориметр КФК-2МП, пипетки на 0,02 мл и 5,0 мл, пробирки, кюветы толщиной 1 см, приготовленный трансформирующий раствор из набора, при необходимости стандартный раствор гемоглобинцианида, вата, спирт, йод, эфир, стерильный скарификатор. Объект исследования - человек.

Х о д р а б о т ы

Приготовить опытную пробу. Для этого к 5 мл приготовленного трансформирующего раствора добавить 0,02 мл полученной из пальца цельной крови. Разведение крови в этом случае составит 251. Полученный раствор тщательно перемешать, выдержать 5-10 минут, а затем перенести в кювету фотоэлектроколориметра.

Приготовить кювету с трансформирующим раствором. Для этого отмерить 5 мл трансформирующего раствора и перенести его в аналогичную кювету (как для разбавленной крови).

Произвести измерение:

1. Открыть крышку фотоколориметра.

2. Включить прибор.

3. Нажать кнопку ПУСК, на индикаторе появится мигающая запятая. Выдержать 15 мин, если прибор не прогрет.

4. Нажать кнопку Ш/О, на индикаторе слева от мигающей запятой высвечивается при нормальной работе прибора значение от 0,001 до 1,000.

5. Поместить кювету с трансформирующим раствором в дальнюю позицию кюветного отделения, а кювету с опытным раствором - в ближнюю позицию. Крышку закрыть, ручку смены кювет переместить в положение "1".

6. Нажать кнопку К/1, на индикаторе появится значение "1", что соответствует режиму измерения трансформирующего раствора.

7. Ручку смены кювет установить в положение "2".

8. Нажать кнопку t/2, на индикаторе высветится искомый показатель экстинкции опытного раствора (разбавленной крови).

9.Повторить пункты 3-8 еще два раза, вычислить среднее арифметическое из трех измерений.

Расчет содержания гемоглобина в исследуемой крови произвести по формуле:

Еоп

Нb (г/%) ————— х С х К х 0,001 где:

Ест

Еоп - экстинкция опытной пробы;

Ест -экстинкция стандартного раствора (определяется однократно для одного набора из 200 проб);

С - концентрация гемоглобинцианида (59,8 мг/%);

К - степень разведения крови (в 251 раз).

Перевести количество гемоглобина в единицы СИ. Для этого полученные по формуле значения умножить на 10 и выразить результаты в г/л.

В выводе содержание гемоглобина в исследуемой крови сравнить с нормой.

Работа 1.11. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦВЕТОВОГО ПОКАЗАТЕЛЯ КРОВИ

Цветовой показатель (ЦП) отражает насыщенность эритроцитов гемоглобином.

Ц е л ь р а б о т ы: освоить методику и рассчитать ЦП крови.

Д л я р а б о т ы н е о б х о д и м ы: данные количества эритроцитов и содержания гемоглобина в крови.

Х о д р а б о т ы

У испытуемого определяют количество эритроцитов и гемоглобина в крови. Расчет цветового показателя производят по формуле:

Hb г/л х 3

ЦП = —————— где:

А

А - число эритроцитов в 1 мкл (первые три цифры).

ЦП можно определить по номограмме (рис.4)

Рис.3. Номограмма для определения величины цветового показателя.

а- шкала величин цветового показателя, б - шкала процентного содержания гемоглобина по Сали, в - число эритроцитов в одном мкл.

Полученную величину цветового показателя сравнить с нормой.

Работа 1.12. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГРУППЫ КРОВИ

Групповая принадлежность крови определяется содержанием агглютиногенов (А и В) в эритроцитах и агглютининов (a и b) в плазме крови.

Ц е л ь р а б о т ы: освоить методику определения группы крови и определить групповую принадлежность крови испытуемого.

Д л я р а б о т ы н е о б х о д и м ы: предметное стекло, стеклянные палочки, стандартные сыворотки I, II, III групп, вата, спирт, йод, эфир, стерильный скарификатор. Объект исследования - человек.

Х о д р а б о т ы

Предметное стекло поместить на белую бумагу и нанести (не смешивая) по капле стандартной сыворотки I, II и III групп. Рядом с каплями стандартных сывороток поместить на предметное стекло небольшие капельки полученной из пальца крови (примерно 1/3 от капли сыворотки). Тщательно размешать, соединив чистой сухой щтдельной стеклянной палочкой капли крови и сыворотки, пока смесь не примет равномерного розового цвета.

Рис. 5. Схема определения групп крови.

Реакция агглютинации наступит через 1-5 мин (рис.5). При наличии агглютинации капля становится прозрачной, а эритроциты склеиваются в виде комочков.

1. Отсутствие агглютинации в каждой из трех смешанных капель совороток позволяет отнести исследуемую кровь к 0(I) группе.

2. Если агглютинация произошла в каплях сывороток I и III групп, то исследуемая кровь принадлежит к A(II) группе.

3. Если агглютинация произошла в каплях сывороток I и II групп, то исследуемую кровь принадлежит к B(III) группе.

4. При наличии агглютинации в каплях сывороток I, II и III групп, то исследуемая кровь принадлежит к AB (IY) группе.

Отметить групповую принадлежность исследуемой крови.

Работа 1.13. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕЗУС-ФАКТОРА (Rh) КРОВИ

В эритроцитах 85 % людей, кроме агглютиногенов А и В, содержится особый антиген, называемый резус-фактором (Rh). При переливании резусположительной крови резусотрицательному реципиенту, у последнего на резус-фактор вырабатываются антитела, которые при повторном вливании резусположительной крови вызовут агглютинацию эритроцитов донора, приводящую к патологическому состоянию.

Ц е л ь р а б о т ы: освоить методику определения резус- фактора и определить резус-принадлежность исследуемой крови.

Д л я р а б о т ы н е о б х о д и м ы: стандартная антирезус-сыворотка и контрольная сыворотка (не содержащая антирезус антител), предметное стекло, стеклянная палочка, свежая кровь, вата, спирт, йод, эфир, стерильный скарификатор. Объект исследования - человек.

Х о д р а б о т ы

На предметное стекло нанести одну каплю стандартной антирезус-сыворотки с одной стороны (например справа), и с другой стороны стекла - каплю контрольной сыворотки ( при наличии ее). На стекло рядом с каждой сывороткой поместить по одной капле исследуемой крови (размер капли должен быть вдвое меньше, чем капля сыворотки). Затем чистой сухой стеклянной палочкой перемешать каплю крови с каплей стандартной антирезус- сыворотки, образуя общую каплю. Подобным образом чистой сухой стеклянной палочкой перемешать кровь со стандартной сывороткой. Наблюдать за реакцией, покачивая предметное стекло с каплями. Для лучшего выявления агглютинации или ее отсутствия можно добавить в обе пробы по капле физиологического раствора. При наличии агглютинации эритроциты склеиваются в виде комочков.

Если исследуемая кровь резус-положительна, то в пробе со стандартной антирезус сывороткой будет наблюдаться агглютинация эритроцитов (в контроле ее быть не должно). Если кровь резус-отрицательная, агглютинация отсутствует в обеих пробах (при возникновении агглютинации в пробе с контрольной сывороткой определение следует повторить, либо проводить другим методом).

В выводе отметить Rh-принадлежность испытуемой крови.

Работа 1.14. ПОДСЧЕТ КОЛИЧЕСТВА ЛЕЙКОЦИТОВ

Лейкоциты представляют собой клеточные элементы, непосредственно участвующие в иммунозащитных реакциях. Они в отличие от эритроцитов содержат ядра и обладают способностью выходить из кровеносного русла и самостоятельно передвигаться.

Ц е л ь р а б о т ы: освоить методику и определить количество лейкоцитов в исследуемой крови.

Д л я р а б о т ы н е о б х о д и м ы: микроскоп, счетная камера Горяева, меланжер для подсчета лейкоцитов , 5 % раствор уксусной кислоты с метиленовой синью, покровные стекла, регулируемая пипетка, пробирки, вата, спирт, йод, эфир, стерильный скарификатор. Объект исследования - человек.

Х о д р а б о т ы

Камеру Горяева предварительно подготовить путем притирания покровного стеклышка к боковым выступающим граням камеры до появления цветных (ньютоновских) колец. В каплю свежей крови погрузить кончик меланжера (смесителя) для лейкоцитов с белой бусинкой в расширении (см. рис.1) и набрать кровь до метки 0,5 без пузырьков и быстро, пока кровь не свернулась, перенести кончик меланжера в раствор уксусной кислоты, подкрашенной метиленовой синью. Раствор уксусной кислоты набрать до метки 11, при этом кровь разводится в 20 раз. После этого взять заполненный меланжер, зажать его концы 1 и 3 пальцами, и в течении 1 мин его встряхивать. После тщательного перемешивания крови, удалив предварительно 1-2 капли, нанести небольшую капельку на сетку камеры.Если капля слишком велика, то жидкость может попасть на боковые грани камеры и высота слоя над сеткой будет больше 0,1 мм, дальнейшие расчеты будут ошибочны. В этом случае камеру следует промыть дистиллированной водой, насухо вытереть и заполнить снова. Разведенную в меланжере кровь следует еще раз перемешать.

При необходимости разведение такой степени может быть выполнено другим способом, например, смешиванием 0,1 мл крови с 2,0 мл 5 % уксусной кислоты в пробирке. Содержимое пробирки в этом случае следует тщательно перемешать.

Заполнив камеру, поместить ее под микроскоп и приступить к подсчету. Лейкоциты удобнее считать при малом увеличении. Подсчет производить в 25 больших квадратах, что составляет 400 маленьких квадратиков. При подсчете пользоваться правилом Егорова:

лейкоциты, лежащие на правой и нижней границах (линиях) данного квадрата не учитываются.

Формула для вычисления количества лейкоцитов в 1 мм³ крови:

В х 4000 х 20

N = —————— где:

400

N - искомое число лейкоцитов;

В - число лейкоцитов в 25 больших (400 малых) квадратах;

4000 - множитель для получения содержания лейкоцитов в 1 мкл крови;

400 - число маленьких квадратиков в 25 больших квадратах;

20 - степень разведения крови.

Для перевода количества лейкоцитов в единицы СИ, полученную величину умножить на 10⁶ и выразить в N х 10⁹ (гига на литр).

Сравнить найденное количество лейкоцитов в крови испытуемого с нормой.

Работа 1.15. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СКОРОСТИ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ

ПО АЛЬТГАУЗЕНУ

Существует целый ряд методов для определения времени свертывания крови, при использовании которых получаются различные цифровые данные. Нормальные показатели скорости свертывания крови при использовании данного метода 5-6 мин при комнатной температуре.

Ц е л ь р а б о т ы: освоить методику и определить время свертывания крови по Альтгаузену.

Д л я р а б о т ы н е о б х о д и м ы: секундомер, стерильный скарификатор, спирт, вата, йод, эфир, предметные стекла.Объект исследования - человек.

Х о д р а б о т ы

Предметное стекло согреть на ладони до температуры тела и нанести на него 2-3 капли крови, взятой из пальца по известной методике. Через каждые полминуты проводить через кровь скарификатором, пока за иглой не потянется первая нить фибрина. Стекло при этом держать на ладони, либо на слое марли.

В выводе сравнить полученный результат с нормой.

Работа 1.16. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СКОРОСТИ ОСЕДАНИЯ ЭРИТРОЦИТОВ (СОЭ) ПО Т.П.ПАНЧЕНКОВУ.

Предотвращенная от свертывания цитратом натрия кровь при отстаивании разделяется на верхний светлый слой ( плазма ) и нижний красный слой (эритроциты).

Ц е л ь р а б о т ы: освоить методику определения СОЭ и определить ее величину в исследуемой крови.

Д л я р а б о т ы н е о б х о д и м ы: прибор Панченкова, 5 % р-р цитрата натрия, стерильный скарификатор, часовое стекло или другая емкость для смешивания, вата, спирт, йод. Объект исследования - человек.

Х о д р а б о т ы

Капилляром из прибора Панченкова (рис. 5) набрать 5 % раствор цитрата натрия до метки Р и выпустить его на часовое стекло.

Проколоть палец, погрузить в каплю крови кончик капилляра и, наклоняя, набрать кровь до метки К. Содержимое выдуть на

часовое стекло в раствор цитрата натрия. Тотчас набрать кровь второй раз до метки К и эту порцию также выдуть на часовое стекло. Быстро перемешать кровь на часовом стекле, набрать в капилляр смесь до метки 0 (К) и закрыть пальцем верхний конец капилляра, чтобы его содержимое не вытекало. Упереть нижний конец капилляра в нижнюю резиновую полоску прибора

Рис.5. Прибор Панченкова для определения СОЭ. А-общий вид, Б-капилляр, В - часовое стекло.

Панченкова и затем вставить верхний конец в резиновую полоску сверху.

Отметить время и ровно через час измерить высоту столбика прозрачной плазмы.

Записать величину СОЭ в мм/час.

Сравнить полученные показатели СОЭ с нормой.

Работа 1.17. ИЗУЧЕНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ ГЕМОЛИЗА

Гемолизом называется разрушение эритроцитов с выходом гемоглобина в плазму крови. Гемолизированная кровь прозрачна и имеет специфический красный цвет ("лаковая кровь").

Ц е л ь р а б о т ы: освоить методику и изучить различные виды гемолиза.

Д л я р а б о т ы н е о б х о д и м ы: штатив с пятью пробирками, пипетки, физиологический раствор, дистиллированнная вода, 5 % раствор аммиака, 0,1 % раствор НСI, цитратная кровь, вата, спирт, йод, эфир, стерильный скарификатор. Объект исследования - человек.

Х о д р а б о т ы

В штатив поставить 5 пробирок, в каждую из которых поместить по 2-3 капли крови. В первую и пятую пробирки добавить по 3 мл физиологического раствора, во вторую - 3 мл дистиллированной воды, в третью - 3 мл 0,1 % раствора НСl, в четвертую - 3 мл 5 % раствора аммиака. Разбавленную кровь в пятой пробирке заморозить в холодильнике. Затем пробирку вынуть и содержимое оттаять в горячей воде.

Рассмотреть все пробирки, сравнить результат. Необходимо определить наличие или отсутствие гемолиза. Описать механизм гемолиза в каждой пробирке. В выводе отметить наблюдаемые виды гемолиза.

Работа 1.18. ИЗУЧЕНИЕ ОСМОТИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ

ЭРИТРОЦИТОВ

Осмотическая резистентность - способность эритроцитов противостоять понижающемуся осмотическому давлению, зависит от свойств мембраны эритроцитов.

Ц е л ь р а б о т ы: освоить методику и определить границы осмотической резистентности эритроцитов.

Д л я р а б о т ы н е о б х о д и м ы: штатив с 8 пробирками, растворы NaCl убывающей концентрации от 0,85 до 0,3 %, донорская кровь, пипетки, вата, спирт, йод, эфир, стерильный скарификатор. Объект исследования - человек. Х о д р а б о т ы

Пробирки последовательно пронумеровать и поставить в штатив. Пипеткой налить в пробирки по 3 мл раствора NaCl в таком порядке:

1 - я пробирка - 0,85 % 5 - я пробирка - 0,45 %

2 - я пробирка - 0,70 % 6 - я пробирка - 0,40 %

3 - я пробирка - 0,60 % 7 - я пробирка - 0,35 %

4 - я пробирка - 0,50 % 8 - я пробирка - 0,30 %

Затем с помощью пипетки добавить в каждую пробирку по 3-4 капли крови. Через 5 мин наблюдать результаты - наличие или отсутствие гемолиза.

Записать в какой из пробирок и при какой концентрации раствора NaCl отмечаются первые признаки гемолиза, при какой концентрации кровь полностью гемолизирована.

Определить верхнюю и нижнюю границы резистентности эритроцитов и в выводе сравнить данные с нормой.

Работа 1.19. ИССЛЕДОВАНИЕ БУФЕРНЫХ СВОЙСТВ СЫВОРОТКИ КРОВИ

Постоянство рН крови сохраняется, несмотря на непрерывное поступление в кровь кислых и щелочных продуктов обмена. Особенно много в тканях образуется кислых веществ (углекислота, молочная кислота и др.). Известно, что для того, чтобы сделать реакцию сыворотки щелочной (по фенолфталеину), к ней приходится добавлять в 40-70 раз больше гидроокиси натрия, чем к дистиллированной воде. А чтобы сделать реакцию кислой (по метилоранжевому), к сыворотке нужно прибавить в 300-400 раз больше соляной кислоты, чем к дистиллированной воде.

Постоянство рН крови обеспечивается целым рядом регуляторных механизмов, и в первую очередь - буферными системами.

Ц е л ь р а б о т ы: ознакомиться с методикой и изучить буферные свойства сыворотки крови путем титрования.

Д л я р а б о т ы н е о б х о д и м ы: 4 стаканчика, 2 пипетки на 5 мл, 2 бюретки, сыворотка крови, разведенная в 10 раз, 0,01 н раствор NaOH, 0,1 н раствор НСI, дистиллированная вода, метилоранжевый и фенолфталеиновый индикаторы, стерильная инъекционная игла, вата, спирт, йод, эфир. Объект исследования - кролик.

Х о д р а б о т ы

Для наблюдения буферных свойств крови взять два чистых стаканчика и налить в один 5 мл сыворотки крови, а в другой 5 мл воды. Титрование необходимо начинать с воды, которая не обладает буферными свойствами и служит для контроля. Прибавить в оба стаканчика по капле метилоранжевого и титровать, считая капли, 0,1 н раствором соляной кислоты до появления неисчезающего при взбалтывании красного окрашивания. Для простоты отсчет титрования ведут в каплях.

Затем взять еще два стаканчика и снова прилить в один 5 мл сыворотки крови, а в другой - 5 мл воды. Прибавить в каждый стаканчик по капле фенолфталеина и, считая капли, титровать 0,01 н раствором гидроокиси натрия до неисчезающего в течение минуты слабого фиолетового окрашивания (для более точного сравнения нужно поставить оба стаканчика рядом на белую бумагу).

Сформулировать вывод о том, что доказывает проведенный опыт.

КОНСТАНТЫ СИСТЕМЫ КРОВИ

Количество крови у взрослых (6-8 % массы тела) 4,5 - 6 л

(у новорожденных 15 % массы тела)

Гематокрит (м) 0,44 - 0,46

(ж) 0,41 - 0,43

Кровь: депонированная 45 - 50 %

циркулирующая 50 - 55 %

Объем плазмы крови около 3 л

Состав плазмы крови:

вода 90 - 92 %

сухой остаток 8 - 10 %

общий белок 65 - 80 г/л

альбумины 45 г/л

глобулины 20 - 35 г/л

фибриноген 3 г/л

остаточный азот 14,3 - 28,5 ммоль/л

глюкоза (цельная кровь) 3,30 - 5,55 ммоль/л

(плазма,сыворотка) 3,88 - 6,10 ммоль/л

триглицериды 0,40 - 1,81 ммоль/л

неорганические вещества 0,9 %

Осмотическое давление крови 7,6 - 8,1 атм

Онкотическое давление крови 0,03 - 0,04 атм

Вязкость крови у взрослых 5

у новорожденных 10,0 - 14,8

Относительная плотность (уд.вес) 1,050 - 1,060

у новорожденных 1,060 - 1,080

рН крови артериальной 7,40

венозной 7,35

Крайние пределы рН, совместимые с жизнью 7,0 - 7,8

Эритроциты: диаметр 7,2 - 7,7 мкм

толщина 2,2 мкм

объем 76 - 96 мкм³ (фл)

общая поверхность всех

эритроцитов 3800 м²

Состав: вода 60 %

сухой остаток 40 % (из него

90 % Hb)

Количество эритроцитов: (м) 4,5 - 5,0 х10¹² л (тера на литр)

(ж) 3,8 - 4,5 х10¹² л (тера на литр)

Продолжительность жизни эритроцита 120 - 130 дней

Количество гемоглобина (м) 130 - 160 г/л

(ж) 115 - 145 г/л

Разновидности Hb: HbP - на 7-12 неделе антенатального периода

HbF - на 9 неделе антенатального периода

HbA - перед рождением и у взрослых

Цветовой показатель взрослые 0,8 - 1,0

новорожденные 0,9 - 1,3

Содержание Hb в эритроците 27 - 31 пг

Концентрация Hb в эритроците 30 - 38 %

Осмотическая резистентность эритроцитов:

Min 0,46 - 0,48 % р-р NaCI

Max 0,32 - 0,34 % р-р NaCI

СОЭ (м) 1 - 10 мм/ч

(ж) 2 - 15 мм/ч

новорожденные 1 - 2 мм/ч

Лейкоциты: количество у взрослых 4 - 9 х10⁹ л (гига на литр)

у новорожденных 15 - 20 х10⁹ л (гига на литр)

Лейкоцитарная формула (%):

Нейтрофилы: Эозинофилы 1 - 5

миелоциты 0 Базофилы 0 - 1

метамиелоциты 0-1 Лимфоциты 20 - 40

палочкоядерные 1-5 Моноциты 2 - 10

сегментоядерные 45-70

Индекс регенерации (сдвиг влево) 0,05 - 0,1

Т-лимфоциты(% от всех лимфоцитов) 40 - 70

В-лимфоциты (% от всех лимфоцитов) 20 - 30

Нулевые клетки (% от всех лимфоцитов) 10 - 20

Количество тромбоцитов 180 - 320 х10⁹ /л (гига на литр)

Продолжительность жизни тромбоцита 5 - 11 дней

Время свертывания крови (по Ли-Уайту) 5 - 7 мин

Лимфа: рН 7,35 - 9,0

относительная плотность 1,012 - 1,023

белки 20 г/л