Бх лекция Belki-2012

Вскоре после начала элонгации 5'- конец транскрипта защищается «кэпом».

Как только транскрипция доходит до сайта полиаденилирования (обычно это последовательность

...ААТААА...

После этого полимераза прекращает транскрипциюи диссоциирует от ДНК.

Созревание РНК

Большинство клеток организма содержит полный набор генов.

Но обычно из этого набора используется крайне незначительный объем информации. Постоянно транскрибируются только те гены, которые кодируют структурные белки и ферменты промежуточного метаболизма. Кроме этих постоянно необходимыхгенов имеетсямного других генов, активных только в определенных типах клеток, при

определенных метаболическихусловиях или во время дифференцировки

101

Контроль транскрипции осуществляется структурами двух типов.

Большинство генов содержат в своем

промоторном участке несколько коротких сегментов ДНК (DNA) (регуляторные элементы, цис-

действующие элементы), с которыми могут связываться факторы транскрипции.

Регуляторные элементы, стимулирующие транскрипцию связанных с ними генов, называются энхансерами (усилителями, от англ. enhancer).

Белки, подавляющие транскрипцию. — сайленсерами (успокоителями, от англ. silencer).

Факторытранскрипции — это белки, т. е. продукты других, независимыхгенов.

Поэтому их называют опосредованно действующими факторами.

Для процесса транскрипции генов требуются не только РНКполимераза,но и другие белки,называемыеосновными факторами транскрипции.

Установлено, что у эукариот таким фактором является ТАТА-связывающийбелок (ТСБ,

англ. ТАТА-ВохBinding Protein, TBP), который взаимодействует с основным регуляторным элементом ТАТА-боксом,присутствующим в большинстве генов

102

Дополнительные факторы могут влиять на инициацию транскрипции,связываясь с другими регуляторными элементами.

Отсюда они взаимодействуют с основным транскрипционнымкомплексом,либо активируя, либо ингибируя его. Такие факторы активируют, например,комплексы стероидных гормонов с рецепторами.

По завершении транскрипции из гяРНК вырезаются интроны, содержащие некодирующие последовательности.

Процесс вырезания интронов

Образование сплайсом

103

Сплайсинг РНК катализируется комплексами белков с РНК, известными как «малые ядерные рибонуклеопротеидныечастицы»

Интроны, входящие в гяРНК (hnRNA), имеют специфические последовательности на 3'- и 5'- концах

На первой стадии сплайсинга ОН-группа аденозилового остатка, расположенного в интроне, атакует (при участии мяРНП) и расщепляет фосфодиэфирную связь на 5'-конце интрона (Одновременно в интроне образуется новая связь, которая придает ему форму петли.

На второй стадии терминальная ОНгруппа 5'-концевого интрона атакует связь в 3'-конце интрона.

В результате оба экзона соединяются, а интрон освобождается.

В этой реакции принимают участие пять различных мяРНП (U1, U2, U4, U5 и U6). В каждой из реакций задействованы несколько белковых молекул и одна молекула мяРНК (snRNA).

104

Во времясплайсинга комплексыиз гяРНК и мяРНП образуют сплайсому.Полагают, что мяРНК в сплайсомеобразуют канонические пары друг с другом и с гяРНК и таким образомфиксируют и ориентируют их реакционныегруппы. Собственно катализ обусловленРНК-составляющейсплайсомы Такие каталитические РНК носят название

рибозимов

В генной инженерии часто требуется выделить отдельный, пока еще не охарактеризованный фрагмент ДНК (DNA), например, с целью определения его полной нуклеотидной последовательности. Такая задача решается путем создании библиотек кДНК. Библиотека ДНК состоит из большого количества векторных молекул ДНК, содержащих различные фрагменты чужеродной ДНК.

Например, возможно получить все молекулы мРНК клетки в виде фрагментов ДНК - кДНК (англ. complementary DNA, cDNA) — и

произвольно внедрить эти копии в векторные молекулы.

Библиотека генов может быть получена путем расщепления ДНК клетки на небольшие фрагменты рестриктазами и последующего встраивания этих фрагментов в векторную ДНК.

105

В качестве векторов для получения библиотек ДНК используются бактериофаги (сокращенно:фаги). Фаги — это вирусы, которые инфицируют бактерии, где их геном реплицируется вместес бактериальным геномом.

Библиотекигенов удобны тем, что в них легко вести поиск необходимыхв данный момент фрагментов.

106

Работу начинают с того, что небольшую порцию ДНК, составляющую библиотеку (105106 фагов), разбавляют, смешивая с клетками бактерии-хозяина, и помещают на питательную среду.

Бактерии определенное время растут, образуя на питательной среде плотный мутный слой клеток.

При этом бактерии, зараженные фагом, растут медленнее, чем неинфицированные клетки. Это приводит к образованию прозрачных кольцевых зон, «бляшек».

Клетки в «бляшке» содержат потомство фагов из первоначальной библиотеки. Образовавшиеся колонии переносят на нитроцеллюлозные или найлоновые фильтры, накладывая их на поверхность слоя в чашке, и слегка подогревают.

Если теперь инкубировать фильтр с меченым

олигонуклеотидным зондом,

соответствующим нуклеотидной последовательности целевого фрагмента, произойдет гибридизация зонда с гомологичной последовательностью ДНК.

107

Место связываниязонда можноопределить по радиоактивной или иной метке.После этого выделяют фаг из положительных (несущих метку) бляшеки размножают обычным образом.

Большиеколичества необходимого фрагмента получают с помощью расщепленияДНК рестриктазами.

108

Спасибо за внимание!

109

Биосинтез белка, регуляция. Патология обмена белков. (Белки-5)

Лекция 21

К.б.н., доцент Валентина Тимофеевна Свергун,

доцент кафедры биохимии ГомГМУ

Содержание:

1.Митохондриальный геном. Митохондриальная патология

2.Биосинтез белка, условия и стадии

3.Патология обмена белков

Митохондриальный геном в клетках человека представлен множеством кольцевых,

2-нитевых молекул ДНК.

Одна молекула mtДНК имеет размер 16599 пар оснований (п.о.) и содержит 13 генов, кодирующих белки-субъединицы ферментных комплексов системы окислительного фосфорилирования.

110