12. Принципы устройства иммерсионного, люминесцентного, электронного микроскопов. Типы микроскопических препаратов.

Тип микроскопии	Вид микроскопии	Используемый микроскоп	Эффект (принцип метода)	Применение в микробиологии
Электронная микроскопия		Электронный	Вместо светового пучка используется пучок электронов	Изучение вирусов Изучение ультраструктуры микробной клетки
Световая микроскопия	Обычная световая	Биологический микроскоп	См. курс физики	В микробиологии используется редко
	Иммер- сионная	Биологический микроскоп + иммерсионный объектив	Иммерсионное масло, помещаемое между предметным стеклом и объективом, устраняет потери попадающих в объектив лучей света вследствие своего одинакового со стеклом коэффициента преломления	Наиболее часто используется в бактериологии для микроскопического метода исследования
	Темно-польная	Биологический микроскоп + темнопольный конденсор	В объектив попадают лишь преломленные на объекте лучи (светлый объект на темном фоне)	Используется для микроскопии очень тонких объектов – например, спирохет
	Фазово-контрастная	Биологический микроскоп + фазово-контрастная приставка	Превращает изменение фазы световой волны, которая меняется при прохождении прозрачных объектов, в воспринимаемое глазом изменение ее амплитуды	Используется для изучения прозрачных, неокрашенных, объектов – например, микоплазм
	Люмине-сцентная (флюоре-сцентная)	Люминесцен-тный (флюоресцен-тный) микроскоп	Регистрирует фотолюминесценцию объекта (свечение под действием ультрафиолета)	Микроскопия мазков, окрашенных флюоресцирующими красками (аурамин, родамин, корефосфин и др.) Оценка реакции иммунофлюоресценции (РИФ)

В лабораторной практике используют следующие типы микроскопических препаратов:

1. Бактериологический мазок (фиксированный мазок). Готовят из патологического материала (гноя, мокроты, фекалий), а также из колоний и чистых культур микроорганизмов.

2. «Висячая» и «Раздавленная» капля. Используют для изучения подвижности микроорганизмов при участии темно-польной микроскопии.

3. Тонкий мазок крови.

4. «Толстая» капля крови.

5. Препарат-отпечаток. Готовят из внутренних органов, мяса, колбасных изделий.

6. Тушевой препарат.

7. Мазки-близнецы (готовят из гноя и мокроты вязкой консистенции).

13. Основные формы микроорганизмов. Этапы приготовления микроскопических препаратов. Способы фиксации.

Различают следующие основные формы бактерий:

• шаровидные (сферические), или кокковидные (от греч. kokkos — зерно);

• палочковидные (цилиндрические);

• извитые (спиралевидные);

• нитевидные.

Кокковидные патогенные бактерии обычно имеют форму правильного шара; некоторые — бобовидную, ланцетовидную, эллипсоидную форму. По характеру взаиморасполо­жения образующихся после деления клеток кокки подразделяют на следующие группы:

1. Микрококки. Делятся в одной плоскости, располагаются одиночно и беспорядочно; сапрофиты; патогенных для человека нет.

2. Диплококки. Деление происходит в одной плоскости с образованием пар клеток, имеющих либо бобовидную, либо ланцетовидную форму.

3. Стрептококки. Деление клеток происходит в одной плоскости, но размножающиеся клетки сохраняют между собой связь и образуют различной длины цепочки, напоминающие нити бус.

4. Стафилококки. Деление происходит в нескольких плоскостях, а образующиеся клетки располагаются скоплениями, напоминающими гроздья винограда.

5. Тетракокки. Деление клеток происходит в двух взаимно перпендикулярных плоскостях с образованием тетрад.

6. Сарцины. Деление клеток происходит в трех взаимно перпендикулярных плоскостях с образованием пакетов (тюков) из 8, 16, 32 и большего числа особей.

Палочковидные (цилиндрические) формы бактерий.

Палочки бывают

длинными — более 3 мкм

короткими — 1,5-3,0 мкм

очень короткими — менее 1,0 мкм — (коккобактерии)

По диаметру их делят на тонкие (Mycobacterium tuberculosis — возбудитель туберкулеза) и толстые (Clostridium perfringens — возбудитель газовой гангрены).

Концы палочек могут быть

• закругленными,

• заостренными,

• утолщенными,

• обрезанными;

• палочка может иметь овоидную (яйцевидную) форму (Yersinia pestis — возбудитель чумы).

По взаиморасположению палочковидные бактерии подразделяют на три группы

1) монобактерии — палочки располагаются одиночно и беспорядочно, сюда относится большинство палочковидных форм;

2) диплобактерии, располагающиеся попарно;

3) стрептобактерии - бактерии, располагающиеся цепочкой.

Извитые (спиралевидные) бактерии по количеству и характеру завитков, а также по диаметру клеток подразделяют на три группы:

1) вибрионы имеют один изгиб, не превышающий четверти оборота спирали

2) спириллы — клетки, имеющие большой диаметр и малое (2-3) число завитков;

3) спирохеты – имеют от 3 до 20-30 завитков

Нитевидные формы бактерий.

Различают два типа нитевидных бактерий:

1. образующие временные нити.

2. образующие постоянные нити

Временные нити образуют палочковидные бактерии при нарушении условий их роста или регуляции клеточного деления. При восстановлении механизма регуляции деления и нормальных условий роста эти бактерии восстанавли­вают обычные для них размеры.

Этапы приготовления фиксированного мазка. Взятие материала для исследования. Для приготовления препарата исследуемый материал берут из пробирки, колбы или чашки Петри бактериологической петлей или стерильной пипеткой. Пробирку с бактериальной культурой берут в левую руку, а петлю за петледержатель — в правую. Петлю прожигают в пламени горелки до покраснения. Вращательным движением вынимают из пробирки ватную пробку, прижимая ее V и IV пальцами правой руки к ладони, и обжигают край пробирки. Осторожно вводят петлю в пробирку, охлаждая ее о внутреннюю поверхность, после чего легким скользящим движением берут материал. Затем вынимают петлю из пробирки, снова обжигают ее край и затыкают пробкой. После приготовления препарата петлю обязательно прожигают (стерилизуют) в пламени. Жидкий материал из пробирки или колбы можно набирать пипеткой, удерживая ее в правой руке и закрывая отверстие II пальцем. Приготовление фиксированных препаратов-мазков. Для приготовления препарата на обезжиренное предметное стекло наносят каплю воды или изотонического раствора хлорида натрия, в которую петлей вносят исследуемый материал и распределяют его таким образом, чтобы получить тонкий и равномерный мазок диаметром около 1—1,5 см, только при таком распределении материала в мазке можно увидеть изолированные бактериальные клетки. Если исследуемый материал содержится в жидкой среде, то петлей его непосредственно наносят на предметное стекло и готовят мазок. Мазки высушивают на воздухе или в струе теплого воздуха над пламенем горелки. Для фиксации мазка предметное стекло (мазком вверх) медленно проводят 3 раза (в течение 3 с) через пламя горелки. Микроорганизмы при фиксации погибают, плотно прикрепляясь к поверхности стекла, и не смываются при дальнейшей обработке. Более длительное нагревание может вызвать деформацию клеточных структур. Мазки крови, мазки-отпечатки органов и тканей и в некоторых случаях мазки из культур фиксируют погружением на 5-20 мин в метиловый синий или этиловый спирт, смесь Никифорова, сулемовый спирт или другие фиксирующие жидкости.