32. Ферменты бактерий. Классификация. Практическое использование биохимической активности микроорганизмов для видовой идентификации.

Классификация ферментов

1) Экзо- 1) Обмена 1) Конститутивные

2) Эндо- 2) Агрессии 2) Индуцибельные

(индуктивные)

По катализируемым реакциям:

Гидролазы

Оксидоредуктазы

Изомеразы

Трансферазы

Лиазы

Лигазы (синтетазы)

По разлагаемым субстратам:

1) протеолитические (протеазы)

2) сахаролитические (карбогидразы)

3) липолитические (липазы)

Ферменты агрессии

инвазивности

• гиалуронидаза

• фибринолизин

• нейраминидаза

• коллагеназа и др.

агрессивности

• лецитиназа (лицитовителлаза)

• коагулаза

• уреаза

• ДНК-аза и др.

1. Карбогидразы - ферменты, разлагающие углеводы. Определяя карбогидразы, выявляют т.н. сахаролитические свойства микробов.

С этой целью используют следующие среды: а) среды Гисса (жидкие и полужидкие с индикаторами). О ферментативной активности бактерий судят по изменению цвета среды и образованию газа; б) дифференциально-диагностические среды с лактозой (Эндо, Левина. Плоскирева и др.); в) полиуглеводные среды (типа Олькеницкого, Клиглера и др.).

2. Протеазы - ферменты, разлагающие белки: а) Для выявления указанных ферментов исследуемую культуру засевают на ряд сред: свернутая сыворотка, столбик желатина (разжижение в положительных случаях), молочный агар в чашке Петри (в положительных случаях вокруг колоний появляются зоны помутнения); б) расщепление аминокислоты триптофана за счет действия фермента триптафаназы сопровождается образованием индола. Последний выявляется с помощью бумажки, смоченной щавелевой кислотой и укрепленной под пробкой над питательной средой. В положительныхслучаях бумажка краснеет; в) для выявления ферментов расщепления серосодержащих аминокислот (цистин, цистеин) ставят пробы на H₂S (бумажка, пропитанная ацетатом свинца, чернеет).

г) для выявление аммиака используют лакмусовую бумагу (посинение). д) для выявления уреазы - фермента, расщепляющего мочевину, в питательную среду нейтральной рН добавляют мочевину и индикатор. В положительных случаях среда изменяет цвет за счет сдвига рН в щелочную сторону в связи с образованием аммиака.

3. Липазы - ферменты разложения липидов и липоидов. Чаще всего определяют лецитиназу посевом на желточный агар. Лецитиназа расщепляет лецитин, при росте колоний вокруг них появляются опалесцирующие зоны, отражающие лецитиназную активность. 4. Гемолизины - ферменты расщепления фосфолипидной мембраны эритроцитов. Они выявляются посевом культуры на кровяной агар (5-10%). Различают бэта-гемолиз или полный гемолиз, когда образуются зоны просветления вокруг колоний, альфа-гемолиз, неполный гемолиз, при наличии зон зеленого цвета вокруг колоний. Отсутствие гемолиза обозначается как гамма-гемолиз. 5. Оксидо-редуктазы: 1. Определение оксидаз. На фильтровальную бумагу, смоченную 1% раствором тетраметилпарафенилендиамина, петлей наносят полосы испытуемой культуры. В положительном случае появляется фиолетовое окрашивание полос (в течение 1 мин). 2. Определение каталазы. Каплю 3% раствора перекиси водорода наносят на предметное стекло и туда вносят петлю испытуемой культуры. В присутствии каталазы образуются пузырьки кислорода. 3. Определение дегидраз. О наличии дегидраз судят по редуцирующей способности микроба, т.е. способности восстанавливать некоторые органические красители (например, 1% водный раствор метиленовой синьки).