Завдання на виконання:

1. Самостійно виділити лімфоцити з периферійної крові в градієнті густин фікол-верографіну (центрифугування, 1500 об/хв, 15 – 20 хв):

1.1. В чисту пробірку №1 наливають 1 мл гепаринізованої крові і додають 3 мл фізіологічного розчину.

1.2. В пробірку №2 наливають 5 мл розчину фікол-верографіну (ρ = 1,077 г/мл). Обережно, по внутрішній стороні пробірки пастеркою з грушею додають 2,5 – 3 мл розведеної крові з пробірки №1.

1.3. Кров центрифугують упродовж 20 хв за кімнатної температури при 1500 об/хв.

1.4. Після центрифугування в пробірці спостерігають чотири фракції (Рис.3.1): І – уламки клітин і еритроцити; ІІ – градієнт густини фікол-верографіну; ІІІ – лімфоцити; ІV – плазма крові.

2. Обережно підвести кінчик пастерки до шару лімфоїдних клітин і за допомогою гумової груші відібрати ці клітини і перенести їх в стерильну пробірку.

3. Клітини відмити в середовищі 199 за допомогою центрифугування (центрифугування 1500 об/хв, 5 – 7 хв).

4. Після центрифугування надосадову рідину злити, до осаду додати 0,5 – 1 мл середовища 199, осад ресуспендувати.

5. Одержану суміш лімфоцитів розділити на кілька проб у різні пробірки, додати Т-систему (проба №3) та В-систему (проба №4).

6. Проби №3 з Т-лімфоцитами (Т-системою) струшують та ставлять на 30 хв у термостат за 37°С, потім на 1 год у холодильник за температури 6 – 8°С. Виймають з холодильника, легенько струшують і виливають на предметне скло. Мазок підсушують і залишають до наступного заняття.

7. Проби №4 з В-лімфоцитами (В-системою) струшують та ставлять на 15 хв у термостат за 37°С. Виймають з термостата, легенько струшують і виливають на предметне скло. Мазок підсушують і залишають до наступного заняття.

8. Провести фарбування мазків крові (Лаб. роб. №2):

Спосіб №1. На мазок крові наносять фарбу-фіксатор Мая-Грюнвальда на 3 хв; фарбу змивають дистильованою водою; потім на мазок наносять розведену фарбу Романовського-Гімзе (розведення 1:2) на 20 хв; мазок змивають дист. водою до стікання чистої води; підсушують на повітрі.

Спосіб №2. На мазок крові наносять етиловий спирт на 20 – 25 хв до випаровування фіксатора; зафіксовані мазки забарвлюють упродовж 20 хв фарбу Романовського-Гімзе (розведення 1:2); мазок змивають дист. водою до стікання чистої води; підсушують на повітрі.

9. Підрахувати формені елементи крові у мазках за допомогою світлового мікроскопу (90) з імерсією: визначити відсоток лімфоцитів, моноцитів, нейтрофілів, еозинофілів та базофілів (закінчення Лаб. роботи №2).

10. Порівняти одержані значення кількості клітин зі значення нормальних показників крові здорової людини або тварин.

10.1. Показники складу крові щурів:

Таблиця 3.1.

Лейкоцитарна формула крові щурів

еритроцити, кл/л	лейкоцити, кл/л	тромбоцити, кл/л	моноцити, %	еозинофіли, %	нейтрофіли
					паличко-ядерні, %	сегменто- ядерні, %
7,94±0,17×1012	6,75±0,44×109	0,025±0,001×1012	1,0±0,18	2,0±0,5	1,92±0,22	26,4±0,24

11. Спостереження гемолізу еритроцитів

11.1.У штатив ставлять 4 пробірки, в які наливають по 3 мл відповідно: в 1-шу – фізіологічного розчину, в 2-гу – дистильованої води, в 3-тю – 0,1 %-го розчину НС1, у 4-ту – 5% розчину аміаку. В усі пробірки вносять піпеткою по 2 краплини цитратної крові. Пробірку з кров’ю, що в ній залишалася, ставлять у морозильну камеру холодильника на одну годину, потім виймають і розморожують у склянці з гарячою водою. Розглядають вміст усіх 5 пробірок, визначають наявність чи відсутність гемолізу.

11.2. Краплину крові розбавте фізіологічним розчином, покладіть на предметне скло і розгляньте під мікроскопом. Згодом на край предметного скла нанесіть краплину дистильованої води, що швидко заходить під покривне скельце і впливає на еритроцити, які спочатку набрякають, а згодом зникають. Якщо на край накривного скельця нанести розчин йоду, то строма еритроцита забарвлюється в жовтий колір.

12. Визначення осмотичної стійкості еритроцитів

Візьміть ряд пробірок, запишіть їх номери, приготуйте розчини кухонної солі різної концентрації(0,2%, 0,9% та 2%), добавте до них по кілька краплин крові, перемішайте і залиште на 1 год. Після цього спостерігайте, в якій пробірці стався повний, частковий, або зовсім не відбувся гемоліз. При повному гемолізі спостерігається забарвлення розчину, при відсутності його залишається прозорим, безбарвним, а еритроцити осядуть на дно; при частковому гемолізі зруйновані еритроцити забарвлюють розчин, а цілі – осядуть на дно. Отже, еритроцити тієї самої крові мають неоднакову осмотичну стійкість відносно гіпотонічних розчинів. Для здорових людей мінімальна стійкість лежить у межах 0,46-0,58% NaCl, а повний гемоліз настає при 0,30-0,32% NaCl.

11. Оформити протокол заняття, зробити висновки.