военная мед фотки и методички / Токсикол

61

Действуя в малых дозах на возбудимые мембраны нервных клеток ЦНС, органические растворители, спирты вызывают седативно-гипнотический. В действии этих соединений, помимо неспецифических, прослеживаются и отчетливые специфические механизмы. Так, вещества со свойствами "неэлектролитов" накапливаясь в мембранах, одновременно изменяют их проницаемость для ионов Na+, K+, Ca+2, Cl- (рис. 15).

(7,4кб, 571x331 GIF)

Рисунок 15. Возможные механизмы непосредственного действия токсикантов на биологические мембраны

Многие токсиканты избирательно действуют на мембраносвязанные энзимы, транспортные системы, рецепторные комплексы к биологически активным веществам. К числу таких в частности относятся гликозиды, агонисты и антагонисты нейромедиаторов и гормонов, блокаторы ионных каналов и многие другие.

4.2.2. Активация перекисного окисления липидов Благодаря ненасыщенности углеводородной цепи жирных кислот и непрочности связи аллильных

атомов водорода с метиленовыми группами, фосфолипиды клеточных мембран наиболее предрасположены к реакции окисления, инициируемой свободными радикалами, образующимися в клетке. Этому способствует и то обстоятельство, что молекулярный кислород в 7 - 8 раз лучше растворяется в липидной фазе, чем в воде и гидрофильных сайтах клетки. Существенная активация процесса образования свободных радикалов при химических воздействиях приводит к усилению перекисного окисления липидов и повреждению биологических мембран. Процесс перекисного окисления усиливается вторичным образованием из липидов высоко реакционно-способных и легко диффундирующих карбонильных радикалов, которые могут обусловливать неблагоприятные процессы, развивающиеся в клетках далеко за пределами сайта своего образования не только клетки, но и органа.

Не смотря на многочисленные исследования до настоящего времени нет четких представлений о значении активации перекисного окисления липидов для развития токсического процесса, инициируемого даже такими мощными прооксидантами, как паракват, адриамицин, нитрофурантион и т.д.

Для развития патологического процесса важно, чтобы окислительно-восстановительный цикл превращения ксенобиотика "работал" достаточно долго, с тем, чтобы произошло истощение механизмов антирадикальной защиты клетки (см. выше). Поскольку непродолжительная инициация окислительновосстановительного цикла трансформации ксенобиотика может стимулировать систему антиокисдантной защиты, при интоксикациях некоторыми прооксидантами возможно развитие парадоксальной реакции, а именно - угнетение процесса окисления липидов в тканях.

Для развития процесса важна степень насыщенности тканей кислородом. В полностью аэробной среде образующийся из ксенобиотика восстановленный метаболит подвергается быстрому обратному окислению. При этом значительно возрастает количество радикалов в виде вторичных активных форм кислорода. Поэтому хорошо снабжаемые кровью и насыщенные кислородом ткани (легкие, сердце, головной мозг) являются более чувствительными к повреждающему действию прооксидантов.

4.2.3. Активация фосфолипаз Важным механизмом повреждения биологических мембран является гидролиз фосфолипидов,

наступающий вследствие активации фосфолипаз (особенно фосфолипазы A2). Активация энзима происходит в результате прямого или опосредованного (гипоксия, нарушение гомеостаза внутриклеточного кальция и т.д.) действия многих токсикантов на клетки организма (рисунок 16).

Результатом действия фосфолипазы А2 на липиды биологических мембран является высвобождение арахидоновой кислоты. Последняя является, в свою очередь, субстратом энзима циклооксигеназы. Превращение арахидоновой кислоты под влиянием энзима приводит к образованию эйкозаноидов (простагландинов, тромбоксанов, простациклинов) - веществ, активирующих воспалительные процессы в тканях. Под влиянием другого энзима, 5-липоксигеназы, арахидоновая кислота превращается в лейкотриены и эйкозатетраеноевые кислоты. Эти вещества являются химиоатрактантами нейтрофилов, веществами, регулирующими сосудистую проницаемость.

Еще одним продуктом энзиматического расщепления липидов мембран является фактор агрегации тромбоцитов (ФАТ) - клон биологически активных веществ (более 150 аналогов) близкого строения. ФАТ чрезвычайно токсичные вещества (LD50 для кролика - 0,005 мг/кг; для собаки - 0,07 мг/кг), вызывающие при внутривенном введении шокоподобное состояние (острый, некупируемый коллапс, бронхоспазм и др.).

1. Угнетение активности ДНК-полимераз и других ферментов синтеза.

Эдеин и налидиксовая кислота угнетают активность ДНК-полимераз, а N-диметилрифампицин подавляет РНК-зависимый синтез ДНК (ингибитор ревертазы). Соединения, нарушающие конформацию ДНК, могут подавлять реакцию её полимеризации, не изменяя активность соответствующих энзимов.

2. Влияние на синтез дезоксирибонуклеотидов.

Элементарной единицей ДНК являются дезоксирибонуклеотидтрифосфаты. Их синтез осуществляется в организме и может быть прерван на различных этапах (синтез пуринов, пиримидинов, нуклеотидов). Вещества, нарушающие синтез нуклеотидов, называются антиметаболитами. В качестве антиметаболитов могут выступать различные аналоги естественных предшественников нуклеотидов, которые вытесняют их из связи с энзимами. Частично эти аналоги перерабатываются и встраиваются в структуру нуклеиновой кислоты (2-аминопурин, 5-флюороурацил), при этом нарушается строение и функция последней. Некоторые вещества (нуклеозидные антибиотики - кордицепин) блокируют встраивание дезоксирибонуклеотидов в молекулу ДНК.

3. Влияние на регуляцию синтеза ДНК.

В качестве регуляторов репликации, у эукариотов выступают цитоплазматические факторы - специальные белки, ответственные за процесс инициации. Их проникновение в ядро показано экспериментально. Определенную роль играют также гуморальные факторы роста, гормоны. Так, кортикоиды и глюкагон усиливают синтез ДНК.

4. Действие на разрушение ДНК и её репарацию.

Эндонуклеазы и лигазы - энзимы, участвующие в репарации мутированных или неправильно синтезированных молекул ДНК. Так, поврежденный нуклеотид может быть вырезан из молекулы ДНК (эндонуклеазы), а на его место встроен неповрежденный фрагмент (лигазы). Резкое повышение внутриклеточной концентрации Са2+, наблюдающееся при острой интоксикации некоторыми токсикантами (см. выше), сопровождается активацией эндонуклеаз и разрушением ДНК.

Ингибиторы лигаз угнетают процессы репарации ДНК и повышают частоту мутаций (например, бензамид и его производные).

5. Другие механизмы действия.

Помимо повреждения ДНК и ферментов, участвующих в её синтезе и репарации, существуют и другие способы токсического нарушения процесса репликации. Так, в фазе приготовления к митозу возможно повреждение центриолей и синтеза митотического аппарата, образующего клеточное веретено. Веретено формируется SH-содержащими протеинами, которые благодаря -S-S- связям образуют нитевидные структуры. Естественно, токсиканты, взаимодействующие с SH-группами способны повреждать митотические веретена. Примерами таких токсикантов являются мышьяк, ртуть и их соединения, колхицин, подофилотоксин и др.

5.2. Синтез РНК. Транскрипция В клетках определяются несколько форм РНК. Особое функциональное значение имеют: м-РНК, как

матрица для синтеза полипептидов, t-РНК - молекула-переносчик аминокислот на рибосомы для их последующей полимеризации, r-РНК - составная часть рибосом. Возможны следующие механизмы повреждения РНК:

1. Нарушение конформации и свойств ДНК (см. выше).

На поврежденной ДНК синтезируется измененные молекулы РНК, не свойственные организму. 2. Угнетение активности РНК-полимераз.

Ингибитором РНК-полимеразы является, в частности, аманитин - яд бледной поганки. 3. Влияние на РНК-процессинг.

Это явление изучено недостаточно. Полагают, что кордицепин (см. выше) ингибирует начало процесса синтеза РНК.

4. Угнетение синтеза нуклеотидов.

Как уже указывалось, целый ряд веществ, так называемых антиметаболитов, способен угнетать синтез пуриновых и пиримидиновых оснований и нуклеотидов. Такие вещества, прежде всего, нарушают обмен РНК, находящихся в состоянии активного обращения. Возможно извращение синтеза РНК вследствие встраивания в молекулу "ложных" нуклеотидов (5-бромурацил, 8-азагуанин).

5. Нарушение регуляции синтеза РНК.

Синтез РНК контролируется целым рядом факторов. Большая часть генома находится в репримированном состоянии, т.е. блокирована специальными белками (гистонами) и не участвует в процессе транскрипции. Активация этих отрезков молекулы ДНК осуществляется низкомолекулярными хромосомными РНК, цитоплазматическими протеинами и другими факторами (например гормонами). Так,

65

единичной клетке макроорганизма, при стечении обстоятельств, может стать причиной мутогенеза, тератогенеза, канцерогенеза. Вероятность такого события бесконечно мала, но теоретически возможна. Такой характер действия веществ на биосистемы называется беспороговым.

Другим, важным с позиции токсикологии, последствием действия химических веществ на процессы синтеза белка является индукция микросомальных ферментов и, следовательно, изменение скорости и характера метаболизма ксенобиотиков. Значение этого эффекта неоднозначно, поскольку в итоге токсичность одних веществ уменьшается, других - возрастает (см. раздел "Метаболизм ксенобиотиков").

66

ГЛАВА 2.2. МЕХАНИЗМЫ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ В основе токсического действия веществ лежит повреждение клеток, сопровождающееся их

функциональными, либо структурно-функциональными изменения. Разнообразие формирующихся при этом эффектов со стороны целостного организма обусловлено сложностью организации клеток, многообразием клеточных форм, составляющих организм. Сформировавшиеся в процессе эволюции особенности структуры и функции отдельных клеточных типов, формирующих различные органы и ткани, настолько существенны, что чувствительность различных клеток к токсикантам может отличаться в тысячи раз. Тем не менее, живое объединено общностью фундаментальных свойств (см. выше), а это позволяет выделить и некоторые общие механизмы, лежащие в основе цитотоксического действия ксенобиотиков. К числу важнейших можно отнести следующие:

-нарушение энергетического обмена;

-нарушение гомеостаза внутриклеточного кальция;

-активация свободно-радикальных процессов в клетке;

-нарушение процессов синтеза белка и клеточного деления;

-повреждение клеточных мембран;

Необходимо отметить, что все эти механизмы тесно связаны друг с другом. Порой один из них является пусковым, но в дальнейшем особую значимость для судьбы поврежденной клетки приобретают другие. Очень часто два или несколько из упомянутых механизмов связаны между собой по типу "порочного круга".

Вэтой связи их выделение носит искусственный характер и оправдывается только целями данного издания.

1.Нарушение процессов биоэнергетики

1.1. Системы энергообеспечения клетки Если между двумя веществами осуществляется взаимодействие, например:

А + В АВ, то существует и некая константа равновесия, характеризующая силу этого взаимодействия:

К = [ АВ] /([ А] + [ В] ).

Если К = 1, то в равновесном состоянии компоненты реакции А (или В) и АВ находятся в смеси в одинаковых концентрациях. Если К > 1, то в смеси больше продукта реакции АВ, если К < 1, то, напротив, больше исходных ингредиентов А и В. Спонтанное взаимодействие А и В с образованием АВ происходит только тогда, когда К - велика.

Энергетика процесса взаимодействия веществ может быть охарактеризована следующим уравнением:

-RTlnKa = G = H - T S, где Ка - константа равновесия;

R - газовая константа (1,987 кал/град/моль); Т - абсолютная температура;

G - свободная энергия;

Н - энтальпия (энергосодержание веществ);

S - энтропия (степень неупорядоченности системы).

Спонтанно протекают реакции, при которых свободная энергия системы в процессе преобразования уменьшается. Это может быть следствием двух явлений: уменьшение энтальпии или увеличения энтропии

системы. В первом случае говорят об экзотермической реакции ( Н > 0), так как она проходит с

выделением энергии; во втором - об эндотермической. Если G - положительно (свободная энергия системы возрастает), реакция не может идти спонтанно. Для того, чтобы такой химический процесс шел необходимо поступление энергии из окружающей среды, либо сопряжение его с другим, экзэргическим, процессом, например:

Х + АТФ Х-АДФ + Ф G (-)

становится возможным за счет сопряженного экзэргического процесса:

АТФ АДФ + Ф G (-),

в ходе которого образуется промежуточный активный продукт Х-АДФ.

Жизнь клеток и макроорганизмов есть постоянный процесс синтеза сложных молекул (нуклеиновых кислот, белков, полисахаридов, липидов и т.д.), то есть структур с достаточно высокой энтальпией и низкой энтропией. Образование таких молекул означает увеличения свободной энергии системы. Следовательно синтетические процессы невозможны без одновременного протекания экзэргических реакций, обеспечивающих высвобождение энергии, поступающей из окружающей среды и запасенной в форме химических соединений. Основным видом таких реакций в организме является гидролитическое расщепление богатых энергией веществ, содержащих пирофосфатные связи (макроэрги). К их числу относятся: аденозинтрифосфорная кислота (АТФ), аденозиндифосфорная кислота (АДФ), гуанозинтрифосфорная кислота (ГТФ_, цитозинтрифосфорная кислота (ЦТФ), уридинтрифосфорная кислота (УТФ), ацилфосфаты и др. В конечном итоге энергетические возможности клетки определяются запасами макроэргов и, в первую очередь, АТФ.

АТФ постоянно синтезируется в ходе двух клеточных процессов: гликолиза и биологического окисления субстратов (клеточное дыхание). Оба находятся в тесном взаимодействии. Гликолиз проходит в цитоплазме клеток. Дыхание, основной путь образования макроэргов, осуществляется в митохондриях. В процессе дыхания, благодаря совместному действию большого числа ферментов, соответствующие субстраты, образующиеся при метаболизме белков, жиров, углеводов, поступающих с пищей, окисляются кислородом, также поступающим из окружающей среды, с образованием СО2, Н2О и энергии, выделяющейся в форме

67

тепла и запасаемой в молекулах АТФ. Процессы, обеспечивающие поддержания определенного уровня АТФ в клетках организма, составляют основу и сущность их энергетического обмена.

Наиболее уязвимыми для действия токсикантов элементами биологической системы, обеспечивающей образование макроэргов в организме, являются: механизмы биологического окисления (ферменты цикла трикарбоновых кислот, ферменты дыхательной цепи), механизмы сопряжение биологического окисления и фосфорилирования (образования АТФ из АДФ и фосфата), механизмы доставки кислорода к клеткам кровью (рисунок 1).

Рисунок 1. Модель процесса клеточного дыхания. Энергия движения электронов и протонов по цепи дыхательных ферментов обеспечивает работу механизма сопряжения процесса фосфорилирования (кумуляция энергии)

Угнетение активности энзимов гликолиза редко приводит к существенному нарушению энергетического обмена, так как метаболизм других веществ (жиров, белков) может компенсировать этот вид нарушений.

1.2. Механизмы токсического повреждения систем энергообеспечения клетки Нарушение процессов биоэнергетики приводит к повреждению биологических систем, вплоть до их

гибели. Токсиканты могут влиять на энергетические процессы различными способами. Некоторые примеры представлены на рисунке 2.

68

Рисунок 2. Механизмы действия токсикантов на биоэнергетические процессы Мышьяк, ртуть, их органические и неорганические соединения, другие тяжелые металлы, иодацетат и

проч., могут взаимодействовать с сульфгидрильными группами целого ряда энзимов гликолиза и цикла трикарбоновых кислот и подавлять их активность (сульфгидрильные яды). Достаточно избирательно действуют вещества-аналоги природных субстратов (фторацетат, оксид углерода и т.д.). Они взаимодействуют с активными центрами соответствующих энзимов, угнетая отдельные этапы процесса энергообеспечения клеток.

Ингибирование энзимов цикла трикарбоновых кислот (ТК) является пагубным для клетки. Так, некоторые фторированные спирты и фторкарбоновые кислоты (ингибиторы ферментов цикла ТК), являются чрезвычайно токсичными соединениями, вызывающими смертельное отравление в дозах нескольких миллиграмм на килограмм массы.

Большое токсикологическое значение имеют вещества, действующие на цепь дыхательных ферментов. Токсиканты, блокирующие элементы цепи дыхательных ферментов (цианиды, сульфиды), могут в течение нескольких минут привести организм к гибели. Первая ступень цепи дыхательных ферментов чувствительна к седативным средствам (барбитураты).

Некоторые вещества способны разобщать процессы биологического окисления и фосфорилирования. Такими свойствами обладают, как правило, липофильные соединения, содержащие фенольную группировку в молекуле и являющиеся слабыми органическими кислотами: 2,4-динитрофенол (ДНФ), динитро-о-крезол, хлорфенолы, дикумарол, а также салицилаты, арсенаты, тироксин и др. (рисунок 3). Самым активным разобщителем является 3,5-дитретбутил-4-гидроксибензилиден-малононитрил (SКF6847). Это вещество примерно в 1800 раз активнее 2,4-ДНФ и уже в концентрации 0,2 моль на 1 моль цитохрома вызывает максимальное разобщение.

in vitro "разобщители" стимулируют скорость потребления кислорода митохондриями и индуцируют активность АТФазы. in vivo в результате их действия значительно активируются процесс клеточного дыхания, однако содержание АТФ в клетках при этом снижается. Образующаяся в ходе окисления субстратов энергия рассеивается в форме тепла, температура тела отравленного резко повышается,

69

учащается дыхание, появляются тошнота, обильное выделение пота, развивается острая сердечная недостаточность, кома. Интоксикация развивается бурно и заканчивается быстрой гибелью пострадавшего.

Рисунок 3. Структура некоторых разобщителей процесса окислительного фосфорилирования Механизм действия разобщителей до конца не выяснен. Полагают, что они облегчают переход

протонов непосредственно через мембрану из митохондрий в цитоплазму. Двигателем же процесса образования АТФ из АДФ и неорганического фосфата как раз и является градиент протонов по обе стороны мембраны митохондрий, не проницаемой для Н+, поддерживаемый реакциями биологического окисления.

Наконец еще одним механизмом нарушения энергообеспечения клетки является угнетение митохондриальной транслоказы, обеспечивающей транспорт ситезированной АТФ из митохондрий в цитоплазму. Таким образом, действует, в частности атрактилозид, вещество выделяемое из растения Distel Atractylis gummifera, произрастающего в Среднеземноморье (рисунок 4).

Рисунок 4. Структура атрактилозида Непрямым механизмом цитотоксического действия является понижение токсикантами парциального

давления кислорода в тканях.

Нехватку кислорода человек и другие млекопитающие могут переносить только несколько минут. Особенно чувствительными к аноксии являются клетки органов с интенсивным энергообменом (таблица 1).

Таблица 1. Потребление кислорода различными органами крысы

(Field et al., 1939)

Высоко чувствителен к нарушению процессов клеточного дыхания головной мозг. Если периферические ткани способны переживать (хотя и с нарушениями функций) частичную нехватку кислорода в течение нескольких часов, то необратимые изменения в ЦНС наступают спустя 4 - 5 минут после полного прекращения снабжения нейронов кислородом. Поэтому токсиканты, нарушающие кислородтранспортные функции крови также весьма токсичны (оксид углерода, нитро-, аминосоединения и пр.). Оксид углерода связывается с двухвалентным железом гема с образованием карбоксигемоглобина, метгемоглобионообразователи переводят железо гема из двухвалентной в трехвалентную форму. В обоих случаях гемоглобин утрачивает способность связывать кислород в легких и транспортировать его в ткани.

2. Нарушение гомеостаза внутриклеточного кальция

70

Роль кальция, как регулятора физиологических процессов, протекающих в клетке, хорошо известна. Нарушение внутриклеточного гомеостаза этого иона, сопровождающееся существенным повышением его концентрации в цитоплазме клетки, лежит, как полагают, в основе механизма клеточной гибели при целом ряде патологических состояний таких как ишемия, аутоиммунные процессы и т.д. Цитотоксическое действие самых разных токсикантов (цианидов, четыреххлористого углерода, свинца, метилртути, хлордекона, оловоорганических соединений, алкилирующих агентов, диоксина и т.д.) также полагают, хотя бы отчасти, связано с повышением уровня кальция внутри клеток.

В норме низкая концентрация кальция в цитоплазме поддерживается механизмами его активного транспорта через биомембраны и системой его компартментализации (накопление в клеточных органеллах) (рисунок 5).

Рисунок 5. Схема регуляции содержания ионов кальция в цитоплазме.

Обычно поступление Са2+ в клетку по градиенту концентрации уравновешивается его активным выведением, осуществляемым при участии Са2+-транспортной АТФазы в печени и эритроцитах и Na+/Ca2+ обменом в возбудимых тканях. Кроме того, уровень кальция регулируется его секвенированием в клеточных органелдах (ядре, митохондриях, эндоплазматическом ретикулуме), а также связыванием внутриклеточными белками.

Нарушение механизмов поддержания гомеостаза внутриклеточного кальция, как это видно из представленной схемы обмена иона, может стать следствием:

-повреждения биологических мембран и усиления их проницаемости для ионов;

-нарушения биоэнергетики клетки, приводящие к истощению запасов макроэрогов;

-изменения функционального состояния белковых комплексов (в том числе путем действия на соответствующие рецепторы), образующих каналы для Са2+.

Все эти механизмы могут приводить к усилению инфлюкса кальция из внеклеточной жидкости и его высвобождению из депо в цитоплазму клетки. Примеры веществ, повреждающих механизмы поддержания гомеостаза кальция внутри клеток, представлены в таблице 2.

Таблица 2. Некоторые вещества, нарушающие распределение кальция внутри клетки

Цитотоксический эффект в результате стойкого повышения содержания кальция в цитоплазме в настоящее время связывают с развивающимся при этом повреждением целостности цитоскелета и неконтролируемой активацией катаболических энзимов (фосфолипаз, протеаз, эндонуклеаз).

2.1. Повреждение цитоскелета Цитоплазма клетки помимо цитозоля и клеточных органелл, как правило, содержит еще и нитевидные

белковые структуры, которые в массе формируют клеточный скелет. Это образование выполняет не только