военная мед фотки и методички / Токсикол

231

этом случае дегрануляция и высвобождение биологически активных веществ происходит вследствие непосредственного разрушения тучных клеток (цитотоксическое действие).

2.3.3. Иммуногены и аллергены Молекулы, вызывающие иммунный ответ организма, называются иммуногенами. Идентификация

иммуногена может быть осуществлена с помощью моноклональных антител. Как правило, аллергия развивается при действии именно иммуногенов, то есть высокомолекулярных соединений, естественных полных антигенов. Однако становится все более очевидным, что многие низкомолекулярные вещества (производственные токсиканты, лекарства, косметика, экополлютанты и т.д.) также могут вызвать состояние гиперреактивности, т.е. выступить в качестве аллергенов.

Еще со времен Ландштейнера известно, что при определенных условиях возможно формирование иммунной реакции на введение низкомолекулярного вещества, однако при условии, что оно вступит во взаимодействие с высокомолекулярным носителем с образованием так называемого комплексного антигена. Таким образом, важными моментами, определяющими вероятность развития аллергии, являются химические свойства, сенсибилизирующая доза вещества и продолжительность контакта. Для того чтобы вызвать иммунный ответ низкомолекулярное вещество должно обладать свойствами гаптенов, т.е., с одной стороны, иметь возможность взаимодействовать с эндогенными структурами организма, обладающими антигенными свойствами, а с другой, так модифицировать их, чтобы сенсибилизированные этим комплексным антигеном лимфоциты вырабатывали антитела, способные распознавать именно токсикант. Не редко аллергенами являются не сами вещества, а продукты их метаболизма. По-видимому, существует прямая связь между химической реакционной способностью и сенсибилизирующей активностью вещества. Токсиканты, образующие обратимые связи с белками крови не являются аллергенами.

В настоящее время установлено, что в иммунном ответе на комплексный антиген принимают участие как Т-, так и В-лимфоциты. При этом В-клетки распознают гаптен, а Т-клетки - макромолекулярный носитель. Этот принцип реализуется и при формировании реакции на естественные антигены. Антигены, активирующие иммунную реакцию только через взаимодействие с Т-клетками, называются Т-зависимыми антигенами. Антигены, активирующие иммунолгический процесс путем взаимодействия только с В- клетками, называются В-зависимыми антигенами. Количество веществ, действующих исключительно через Т- и В- лимфоциты, крайне мало.

Как указывалось выше, в качестве носителя гаптена могут выступать различные макромолекулы: белки, полипептиды, полисахариды. Особой реакционной активностью при образовании связей с носителем обладают соединения, имеющие в структуре амно-, нитро-, азо-, карбаминовые и некоторые другие группы. Как уже указывалось, во взаимодействие с носителем может вступать не исходный ксенобиотик, а продукт его метаболизма. Таков механизм формирования комплексного антигена, в частности, при действии на организм производных р-аминобензола. Предположительно в ходе метаболических превращений происходит гидроксилирование или окисление NH2-группы вещества. Образующиеся активные радикалы легко вступают во взаимодействие с сульфгидрильными и другими функциональными группами молекулносителей с образованием ковалентных связей (рисунок 4).

Рисунок 4. Взаимодействие лиганда с белком Подобные вещества вызывают аллергические реакции на целую группу соединений, что объясняется

близостью их строения (рисунок 5).

Рисунок 5. р-аминобензол и его производные Совокупность близких по строению аллергенов образует "парагруппу". К "парагруппе" производных

аминобензола относятся, в частности, сульфаниламиды, производные фенотиазина, ацетанилиды, азокрасители, пикриновая кислота и др.

Другими хорошо известными аллергенами являются вещества, также способные образовывать прочные ковалентные связи с белками. Это цианаты, тиоцианаты, изотиоцианаты, альдегиды, галогенсодержащие вещества, тиогликолаты (таблица 6). К числу аллергенов принадлежат также ионы металлов Ni, Co, Zn, Hg, Ag, Cr и др.

Таблица 6. Строение некоторых низкомолекулярных аллергенов

232

Особый вид аллергии, вызываемый ксенобиотиками, представляет фотоаллергия. В данном случае образование прочной связи между молекулой белка и гаптеном, накопившемся в коже, активируется в результате фотохимического превращения последнего, как правило, при действии ультрафиолетовых лучей. В клинической практике нередко встречаются с фотоаллергическими реакциями на хлорпромазин, псорален, сульфаниламидные препараты и др. (см. раздел "Дерматотоксичность").

Сенсибилизирующие свойства вещества могут быть оценены с помощью "индекса сенсибилизации", который представляет собой выраженную в процентах вероятность развития аллергии у лиц, контактирующих с веществом. Индекс сенсибилизации некоторых лекарственных веществ представлен в таблице 7.

Способность сенсибилизировать организм у разных веществ выражена не одинаково. Некоторые соединения (например фенилэтилгидантион, см. рисунок 6) в 90% случаев вызывают аллергизацию (появление экзантемы, отек кожи лица и слизистых оболочек, лихорадка), другие дают осложнение менее чем в 1% случаев.

Рисунок 6. Структура фенилэтилгидантиона. Снотворное средство Важен способ аппликации вещества. Так, пенициллин при приёме через рот вызывает аллергические

реакции менее чем в 1% случаев, при парентеральных способах введения - в 3%, а при аппликации на слизистые - до 15%.

Таблица 7. Индекс сенсибилизации некоторых лекарственных веществ По частоте аллергических реакций, вызываемых медикаментами, на первом месте стоит пенициллин.

Механизм формирования реакции в основном изучен. Антитела формируются на метаболиты пенициллина, в частности пеницилловую кислоту, пеницилленовую кислоту, пеницилламин. Эти соединения взаимодействуют с белками с образованием прочных амидных связей. Возможна перекрестная аллергия к другим препаратам группы пенициллина. Высокой иммуногенностью обладает цефалоспорин. При

расщеплении -лактамного кольца препарата выявляются реактивные группы, обеспечивающие взаимодействие их с белками.

Свойствами аллергенов обладают производные салициловой кислоты, встречающиеся в виде примесей в лекарственных формах препарата (ангидрид ацетилсалициловой кислоты, цис-дисалицилид и др.).

Примерно у 3%, принимающих барбитураты, развиваются аллергические реакции. Как правило, отмечаются кожные проявления (экзантемы, эритема). Производные фенотиазина вызывают контактную сенсибилизацию кожи, аутоиммунный агранулоцитоз, отек Квинке. Наиболее часто реакция развивается у работающих на производствах по выпуску препаратов. Аллергенами также являются некоторые анестетики (новокаин, прокаин, бензокаин), рентгеноконтрастные вещества, вызывающие кожные реакции (эритема, уртикарная сыпь, буллезные изменения кожи, лихорадку), блокаторы адренорецепторов (поражение глаз, серозных оболочек).

У большинства людей при действии иммуногенов происходит сенсибилизация клеток, вырабатываются антитела. Однако далеко не у всех развиваются гиперреактивные реакции. Склонность к развитию гиперреактивных состояний, выявляемая у некоторой части популяции людей, объясняется генетически обусловленными особенностями человека (см. выше). Это еще более усложняет работу по контролю за качеством среды и обеспечению здоровья населения, поскольку у высоко чувствительных сенсибилизированных лиц неблагоприятные эффекты могут развиваться от доз токсикантов значительно ниже допустимых.

Механизмы действия аллергенов суммированы в таблице 8.

Таблица 8. Механизмы действия токсикантов, вызывающих аллергизацию организма и активацию аутоиммунных процессов

-вещество или его метаболиты являются полными антигенами;

-вещество или его метаболиты являются гаптенами, способными образовывать с белками крови иммуногены и аутоантигены;

234

крови. Хроническое воздействие некоторых металлов (ртути, золота, марганца, кобальта и т.д.) вызывая хронический воспалительный процесс в тканях, провоцируют развитие аутоиммунных реакций.

3. Модификация собственных антигенов. Ксенобиотики, взаимодействуя с макромолекулами тканей, могут изменять их конформацию, формировать в них новые детерминанты, вызывать экспрессию "спрятанных" детерминантных групп. В итоге эти структуры перестают восприниматься иммунной системой как "свои". Примером такого взаимодействия является действие дигидролазина (рисунок 7) на нуклеопротеины.

Рисунок 6. Структура дигидролазина. Мочегонное средство Наиболее вероятно возникновение аутоиммунных заболеваний при длительном, хроническом действии

токсикантов на организм. Эту возможность следует иметь в виду при обеспечении здоровья лиц, контактирующих с вредными факторами на производствах, проживающих в экологически неблагоприятных регионах.

3. Краткая характеристика токсикантов 3.1. Бериллий.

Хотя бериллий был открыт еще в 18 веке, его токсическое действие обнаружилось лишь в ХХ.

В 1945-50 годах в США регистрировались эпидемические вспышки острых и хронических интоксикаций бериллием на предприятиях по его производству, выплавке сплавов, изготовлению неоновых ламп, а также среди населения, проживающего близ этих производств. Первоначально патологию, вызванную металлом, принимали за саркоидоз, легочное и мультисистемное заболевание неизвестной этиологии. В настоящее время заболевания острым бериллиозом на предприятиях полностью ликвидированы. Однако экологи полагают, что в связи с увеличением объемов используемого в производстве бериллия возможен рост числа лиц, подвергающихся хроническому воздействию. Коварство бериллия, его способность вызывать реакцию сенситизации заставляют исследователей и практических врачей рекомендовать строгий контроль за состоянием здоровья всех людей, работающих с бериллием.

Заболевание, возникающее в результате длительно воздействия бериллием, называется хроническим бериллиозом и представляет собой гранулематозный процесс, проявляющийся преимущественно в легких, реже в других органах. В отличие от острого поражения, интенсивность хронического воздействия, повидимому, не является важным фактором, определяющим тяжесть поражения. Дело в том, что в основе патологии лежит реакция гиперчувствительности к бериллию, выступающему в качестве антигена или гаптена. Недавние исследования показали, что сенситизация может развиться даже при кратковременном действии металла в очень малых концентрациях. Скрытый период между моментом первого воздействия бериллием и развитием клиники заболевания продолжается от нескольких месяцев до 30 лет. Средняя продолжительность латентного периода 6-10 лет.

Нарушения функций легких при хроническом бериллиозе могут протекать в нескольких формах:

1.преимущественно обструктивный тип (примерно у трети отравленных);

2.рестриктивный тип (у одной четверти пострадавших);

3.снижение диффуззионной способность легких (в тесте с СО) при неизмененных легочных объемах

ипроходимости бронхов (у одной трети пострадавших).

Наиболее ранний симптом - одышка при физической нагрузке. Часто присоединяются боли за грудиной, кашель, артралгии, повышенная утомляемость, потеря веса. При исследовании выявляются двухсторонние хрипы, цианоз, пальцы в форме барабанных палочек, лимфоаденопатия, поражения кожи. В запущенных случаях - правосердечная недостаточность, cor pulmonale. У небольшой части отравленных отмечаются нарушения, выявляющиеся лишь при физических нагрузках в форме увеличения альвеолярноартериального градиента рО2; процесс без нарушения функций на фоне гранулемы в легких и бериллийспецифических иммунологических реакций лимфоцитов легочного лаважа.

При исследовании биоптатов легких у больных выявляются нераспадающиеся гранулемы, мононуклеарные клеточные инфильтраты в интерстиции легких и различной степенью выраженности фиброз легких. В бронхоальвеолярном лаваже обнаруживается большое количество лейкоцитов, увеличенное число лимфоцитов, повышенное соотношение Т-хелперов к Т-супрессорам.

Помимо легких, гранулемы обнаруживаются в печени, селезенке, региональных лимфатических узлах, миокарде, скелетных мышцах, почках, слюнных железах, костях, коже.

Хроническая интоксикация бериллием часто сопровождается гранулематозными изменениями кожных покровов даже в тех случаях, когда прямого действия металла на покровную ткань не было.

У 10% больных выявляется гепатомегалия. Реже в патологический процесс вовлекается ЦНС.

В литературе имеются данные о выздоровлении, наступившем без лечения. Однако на такой исход всегда мало надежды. У большинства больных постепенно прогрессирует дыхательная недостаточность и правожелудочковая недостаточность сердца. В запущенных случаях бериллиоза летальность может составить до 30%.

4. Определение иммунотоксичности ксенобиотиков Стратегия определения иммунотоксичности состоит в последовательном изучении в эксперименте

состояния элементов иммунной системы (от клетки до целостного организма), в условиях воздействия испытуемого токсиканта. Ни одна отдельно взятая методика не является в полной мере надежной и

236

Не смотря на многочисленные данные об иммунотоксических свойствах веществ, получаемых на экспериментальных животных, в силу сложности экстраполяции, сведения о влиянии веществ на человека порой противоречивы. Кроме того далеко не у всех лиц, с признаками иммунотоксического поражения органов (гломерулонефрит, пневмониты, астма, аллергические дерматиты, гепатиты и т.д.) удается легко выявить химическую природу этиологического фактора, определить источник воздействия. Достаточно сложно отличить дисфункцию системы, как следствие какого либо заболевания или недостаточности питания, от химически обусловленной патологии. Поэтому для выявления иммунотоксичности вслед за этапом оценки иммунного статуса обследуемых лиц, должен следовать этап поиска доказательства причинно-следственных связей между выявленными нарушениями и действием токсиканта.

Исследования должны начинаться с тщательного обследования и сбора анамнеза. Необходимо особое внимание уделять выявлению классических проявлений и симптомов иммунных нарушений. Сложные лабораторные тесты могут обеспечить детальную информацию о состоянии гуморального и клеточного компонентов иммунитета, комплемента, фагоцитарных функциях, однако проведение этих тестов в подавляющем большинстве случаев совершенно излишне. Для оценки состояния иммунной системы часто вполне достаточно использовать простые скрининговые методы. Необходимо иметь в виду, что вследствие высокой лабильности иммунной системы, получаемые в ходе обследования результаты, характеризуют её состояние только в данный момент времени.

5.1. Оценка иммунологического статуса Для оценки статуса человека с предполагаемой иммунной патологией Иммунологическая секция ВОЗ

рекомендует использовать тесты, представленные на таблице 11. Таблица 11. Тесты клинического иммунологического скрининга

-Подсчет числа форменных элементов крови. Формула крови

-Количественный электрофорез плазмы крови

Гуморальный иммунитет:

- Количество иммуноглобулинов (IgG, IgM, IgA, IgE) - Титры изоантител

Клеточный иммунитет:

- Кожные тесты на отсроченную гиперреактивность

Аутоиммунный процесс: - Титр аутоантител

Эти исследования следует проводить перед тем, как переходить к более сложным и дорогим диагностическим процедурам (таблицы 12, 13).

Талица 12. Методы оценка состояния гуморального иммунитета

Функция иммуноглобулинов:

-электрофорез белков

-количество иммуноглобулинов в плазме крови

-титр специфических антител (изогаммаглобулины, антистрептолизин О, антитела к возбудителям свинки, кори, полиомиелиту)

-антигенный ответ:

-первичное антителообразование

-вторичное антителообразование

Функция В-лимфоцитов:

-количество В-лимфоцитов с поверхностными иммуноглобулинами (нормальное содержание 4 -10%)

-активация В-лимфоцитов (реакция на митогены, инактивированные антигены, индукцию клеточного деления)

-пролиферация В-лимфоцитов (измерение интенсивности пролиферации путём изучения скорости инкорпорации тимидина, меченого тритием)

-дифференциация В-лимфоцитов (определение колоний антителосекретирующих клеток или определение количества антител в супернатанте культуры клеток; определение продукции иммуноглобулинов индуцированной митогенами Т- и В-лимфоцитов)

Таблица 13. Методы оценка состояния клеточного иммунитета

Подсчёт лимфоцитов Тесты на трансформацию лимфоцитов:

-стимуляция митогенами

-воздействие антигенов

-смешанная культура лимфоцитов Определение лимфокинов:

-фактор ингибирования макрофагов

-фактор угнетения миграции лимфоцитов

-лимфоцитарный хемотаксический фактор

Кожные тесты на отсроченную гиперчувствительность (антигены: свинка, трихофитон, тетанотоксоид и др.)

Лимфоцитарная цитотоксичность, активность естественных киллеров

237

Субпопуляции Т-клеток: соотношение хелперы/супрессоры

Электрофорез белков позволяет быстро установить нормально ли у обследуемого содержание иммуноглобулинов, нет ли дисгаммаглобулинемии. Гипогаммаглобулинемия обычно является следствием вторичного иммунного дефицита. Определение иммуноглобулинов даёт прямую информацию о наличии или отсутствии моноклональной или поликлональной гаммаглобулиноапатии. Основными типами иммуноглобулинов являются IgG, IgM, IgA, IgE их определение оправдано в тех случаях, когда частью клинического синдрома является аллергический компонент. Определение специфичных антител методологически сложно (методы энзимсвязанной иммуносорбции). Наиболее часто развивается дефицит IgA, причем в 50% случаев при этом отсутствуют признаки патологии. Функция этого иммуноглобулина - защита слизистых барьеров организма от инфекции.

Нарушение клеточного иммунитета можно выявить, ориентируясь на симптомы заболеваний, ассоциирующихся с функциями этого механизма резистентности. Как известно, к числу таких функций относятся: уничтожение внутриклеточных патогенных организмов, отторжение опухолевых клеток, отсроченные реакции гиперреактивности, в том числе контактные дерматиты, аутоиммунное повреждение органов и тканей. Наиболее часто дефицит клеточного иммунитета проявляется учащением инфекционных заболеваний вирусной и грибковой этиологии.

Любое уменьшение числа Т-лимфоцитов, выявляемое при подсчете формулы крови, до уровня 75 - 85% от нормального значения, называется лимфопенией. Определение числа Т-лимфоцитов различных типов производится путем подсчета розеток, образуемых с эритроцитами барана и с помощью флюоресцирующих моноклональных антител к зрелым Т-лимфоцитам.

Тест на трансформацию лимфоцитов можно провести in vitro с использованием митогенов (фитогемагглютинин и др.) и растворимых антигенов, добавляя их к культуре клеток.

Кожные тесты на отсроченную гиперреактивность могут быть выполнены с использованием обычных антигенов, таких как антиген возбудителя свинки, Trichophyton, Candida ablicans. Эритематозная кожная реакция с индурацией ткани, размером более 10 мм, спустя 24, 48, и 72 часа после инъекции 0,1 мл антигена под кожу ладонной поверхности предплечия указывает на серьёзную модификацию клеточных механизмов иммунитета (антиген был распознан лимфоцитами, произошла его процессия, активированы Т- клетки, секретированы лимфокины, произошло привлечение в регион несенситизированных лимфоцитов). Позитивный кожный тест на 3 из 5 вводимых антигена выявляется у 95% населения и указывает на адекватную физиологическую реакцию иммунной системы. Отрицательный результат может быть следствием не только дефекта иммунной системы, но и неправильно выполненной пробы. Важнейшим элементом постановки кожного теста является стандартизация используемых антигенов.

Определение аутоантител может оказаться полезным при диагностике системных заболеваний соединительной ткани, активной фазы хронического гепатита, красной волчанки и т.д. Обычно выявляемые антитела специфичны в отношении ядер клеток, ДНК, структурных элементов гладкомышечных волокон, клеток щитовидной железы. Антитела к ядрам клеток иногда определяются у здоровых людей (особенно пожилого возраста), а также у больных ревматизмом. Проявления иммунной токсичности ксенобиотиков очень часто ошибочно приниматься за аутоиммунные заболевания и хронические воспалительные процессы иной этиологии.

С диагностическими целями может быть изучено содержание специфических антител к антигенам, с которыми человек, как правило, контактировал на протяжении жизни. К числу таких антител относятся изогемагглютинины, антистрептолизин-О, антитела к кори, свинке, полиомиелиту и т.д. Для оценки функционального состояния иммунной системы возможно использовать метод изучения иммунного ответа на первичный контакт с антигеном, а также выраженность вторичной иммунной реакции. Обычно исследование проводят путем повторного введения тетанотоксоида с измерением титра вырабатывающихся антител. К действию иммуносупрессоров более чувствительна иммунная реакция на первичный контакт с антигеном.

Дефицит отдельных компонентов системы комплемнта может сочетаться с различными заболеваниями. Показаниями для изучения состояния комплемента являются: частые инфекционные заболевания, системные бактериальные инфекции, подозрения на аутоиммунный процесс. Ряд клинических синдромов связан с неадекватной активацией комплемента. Это, например, хроническая уртикарная сыпь, кожные васкулиты, пурпура, артралгии, артриты, лихорадочные состояния неизвестной природы, нефриты. Снижение содержания в сыворотке крови компонента С4 указывает на недостаточную активацию системы комплемента. Активация системы комплемента и наличие высокого титра антител указывает на патологию иммунного комплекса и аутоиммунный процесс. Позитивная реакция на иммунные комплексы, наличие аутоантител, активация комплемента - свидетельства органной патологии.

Полная оценка фагоцитарных функций иммунной системы включает:

-подсчет числа нейтрофилов в периферической крови;

-определение скорости восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) нейтрофилами;

-изучение хемотаксиса клеток;

-изучение фагоцитарной активности;

Для выявления нарушений нет необходимости проводить все указанные определения. Снижение количества полиморфноядерных нейтрофилов до уровня 1000 и ниже в 1мм3 крови сопряжено с увеличением риска развития инфекционного процесса.

Лейкопению вызывает большое число этиологических факторов, среди них инфекция, токсиканты, ионизирующее излучение. Причинами нейтропении при действии ксенобиотиков (см. раздел "Гематотоксичность") могут быть угнетение костного мозга и аутоиммунный процесс, развивающийся при повторном контакте с токсикантом.

239

К числу активных групп пуриновых и приримидиновых оснований, способных к алкилированию относятся азот в 1, 3, 7 положениях молекулы аденина; азот - в 3,7, и кислород в 6 положении молекулы гуанина; азот - в 3 и кислород - во 2 - цитозина; азот - 3 и кислород - 2 и 4 - тимина (рисунок 3). Помимо азотистых оснований алкилированию могут подвергаться фосфатные группы молекулы ДНК.

Рисунок 3. Участки наиболее вероятного алкилирования ДНК в физиологических условиях Некоторые вещества, используемые в настоящее время в качестве противоопухолевых средств,

являются структурными аналогами пуриновых и пиримидиновых оснований, входящих в ДНК. Поступая в организм, они включаются в синтез ДНК опухолевыми клетками, замещают генуинные нуклеотиды, вызывая летальные мутации. Результатом этого является гибель быстро делящихся клеток опухолей. К числу таких веществ относятся 5-бромурацил, 5-фтордезоксиуридин, 2-аминопурин, 6-меркаптопурин и т.д. Поражение этими веществами здоровых клеток организма, находящихся в фазе деления, может приводить к их мутациям (и пагубным последствиям для организма).

1.2. Выпадение или включение дополнительного нуклеотида Выпадение или включение дополнительного нуклеотида в структуру ДНК кардинальным образом

изменяет триплетный код, с помощью которого храниться информация о последовательности аминокислот в синтезируемом белке. Поскольку выпадение или включение основания приводит к "сдвигу" всей последовательности нуклеотидов (рисунок 4) последствия такой мутации, как правило, пагубны.

Рисунок 4. Выпадение аденина (А*) приводит к сдвигу цепи нуклеотидов влево и полному изменению триплетного кода

Некоторые токсиканты, например производные акридина, способны вызывать подобные изменения в структуре ДНК.

1.3. Репарация ДНК Клетки обладают способностью корректировать и устранять повреждения ДНК. Вследствие этого лишь

небольшое число мутаций, инициированных токсикантом, сохраняется в процессе репликации молекулы. Однако если мутация не распознана, извращенная информация транскрибируется в РНК, а затем экспрессируется в форме неполноценного протеина. Последствия этого для клетки могут быть либо несущественны, либо критичны, в зависимости от функций, выполняемых протеином.

Ряд ферментов, участвующих в репарации поврежденных ДНК, в настоящее время хорошо изучен (см. выше). Например, метилтрансферазы принимают участие в деметилировании О-6-метилгуанина. Гликозилазы расщепляют связи между азотом-9 пурина, подвергшегося алкилированию, образуя участки депуринизированной ДНК. Фрагменты нуклеиновой кислоты, состоящие, как правило, из 3 - 4 нуклеотидов, включая депуринизированный участок, вырезаются из цепи спомощью эндонуклеаз. В дальнейшем удаленные фрагменты заполняются при участии ферментов ДНК-полимераз и "встраиваются" в общую цепь с помощью ДНК-лигаз. Сбои в этом механизме могут приводить к повреждению генетического кода клеток.

2. Хромосомные аберрации Для обозначения процессов, приводящих к делеции (выпадению), перестройке фрагментов хромосом

или появлению дополнительных хромосом, которые выявляются с помощью световой микроскопии клеток, используют термин - кластогенез. Наиболее частой формой кластогенеза являются разрывы хромосом, которые вызываются, например, действием ионизирующего излучения и многих химических веществ. Алкилирующие агенты, особенно содержащие две функциональные группы в молекуле (сернистый,

240

кислородный, азотистый иприты и их производные и аналоги, бисульфан, кармустин и т.д.), образуя поперечные связи с обеими цепочками молекулы ДНК, могут вызвать её разрыв. В основе разрыва лежит депуринизация поврежденных нуклеотидов соседствующих фрагментов обеих нитей ДНК, с последующим их одновременным вычленением с помощью эндонуклеаз (см. выше). Ферментом, принимающим участие в последующей репарации поврежденной ДНК, является поли-АДФ-рибозилполимераза. Аккумуляция в ядре клетки фрагментов ДНК активизирует энзим. Субстратом для образования АДФ-рибозилата, необходимого для восстановления целостности макромолекулы, является никатинамидадениндинуклеотид (НАД). Если ДНК повреждается значительно, на её репарацию расходуется большое количество НАД, что приводит к истощению запасов нуклеотида в клетке и острому энергетическому дефициту. Полагают, что этот феномен также может лежать в основе гибели клеток, подвергшихся действию мутагенов (например, иприта).

В ходе "сшивания" двунитевых разрывов хромосом весьма вероятны ошибки. Основные виды нарушений, возникающих при этом, это делеция, транслокация и инверсия частей хромосом.

Увеличение числа хромосом в клетке может явиться следствием нарушения процесса их разделения в ходе митоза между двумя дочерними клетками. В итоге образуются клетки с большим или меньшим числом хромосом. Иногда кратно увеличивается весь набор хромосом. Это явление называется - полиплоидия. Ряд химических веществ вызывают полиплоидию. К числу наиболее изученных относится колхицин (рисунок 5), связывающийся с мономерами тубулина, блокирующий его полимеризацию и за счет этого нарушающий образование митотических веретен.

Рисунок 5. Структура колхицина Колхицин блокирует митоз в метафазе, вызывая полиплоидию поврежденной клетки. Другими

примерами веществ, действующих подобным образом, являются производные алкалоида винкамина (винкристин, винбластин) и подофилотоксин. Полиплоидия у млекопитающих, как правило, является летальной мутацией (в отличии от растений).

3. Условия действия мутагенов на клетки Все клетки организма находятся в одной из фаз клеточного цикла:

1.Покоя (фаза G0): клетка функционирует или покоится (большинство соматических неделящихся клеток);

2.Синтеза клеточных компонентов, необходимых для последующего синтеза ДНК (фаза G1): идет

накопление необходимого количества пуриновых и пиримидиновых оснований и других химических компонентов ДНК. В делящейся клетке процесс занимает до 40% общего времени цикла клеточного деления;

3.Синтеза ДНК (фазаS): осуществляется "сборка" новой молекулы ДНК из наличествующих в клетке компонентов. Процесс занимает до 39% времени клеточного цикла.

4.Синтеза клеточных компонентов для митоза (фазаG2). В частности синтезируется мономеры и

полимер тубулина и т.д. Процесс занимает около 19% времени цикла делящейся клетки.

5. Митоза (фазаM): разделение генетического материала между вновь образующимися дочерними клетками; клеточное деление. Процесс занимает 2% времени.

Часть химические вещества способны вызывать мутации лишь тех клеток, которые находятся в определенной фазе цикла, это так называемые цикло-специфичные вещества. Другие действуют на генетический аппарат не зависимо от того, в каком периоде клеточного цикла находится клетка (циклонеспецифичные). Такая особенность в действии веществ определяется механизмом, посредством которого токсикант повреждает ДНК (см. выше). К числу цикло-неспецифичных принадлежат мутагены, способные вызывать химическое повреждение нуклеотидов (алкилирующие агенты и химические модификаторы нуклеотидов). Все остальные мутагены являются цикло-специфичными.

4. Изучение мутагенной активности

Изучение мутагенной активности химических веществ осуществляется в опытахin vitro на прокариотических и эукариотических клетках, путем непосредственного изучения степени повреждения ДНК, и выявления хромосомных аберраций у животных, подвергшихся действию токсикантов.

4.1. Исследования в опытах на прокариотах. Тест Эймса В основе теста, разработанного Брюсом Эймсом, лежит способность мутагенов вызывать обратную

мутацию измененного штаммаSalmonella typhimurium, неспособного к биосинтезу гистидина. Микроорганизмы данного штамма не растут в среде, не содержащей гистидин, однако под влиянием мутагенов вновь приобретают эту способность, свойственную исходному штамму сальмонелл (обратная мутация). В настоящее время созданы специальные штаммы, позволяющие выявлять мутации типа "замещение основания" (штамм ТА-1531) и типа "сдвиг цепи нуклеотдидов" (штамм ТА-1537, ТА-1538).

Тест осуществляется на суспензии бактериальных клеток в расплавленном при 450 агаре. В инкубационную среду (не содержащую гистидин) добавляют токсикант. К части проб добавляют также фракцию микросом, выделенных из гепатоцитов крыс, предварительно обработанных полихлорированными бифенилами, с целью индукции цитохромовР-450 (фракцияS-9). Смеси разливают по чашкам Петри. Число