военная мед фотки и методички / Токсикол

162

(K.W. Bock, 1977)

6.3.1.2. Механизмы индукции Индукция предполагает синтез дополнительного количества того или иного энзима в органах и тканях

de novo. Ингибиторы синтеза белка (пуромицин, этионин, циклогексимид), а также ингибиторы синтеза РНК (актиномицин Д) блокируют индукцию микросомальных энзимов. Поскольку блокаторы синтеза ДНК (гидроксимочевина) не эффективны, можно сделать вывод, что феномен индукции энзимов биотрансформации ксенобиотиков реализуется на уровне транскрипции генетической информации.

Механизм феномена полностью не изучен. Одна из первых гипотез была предложена S. Granick в 1966 году для объяснения индукторных свойств стероидов. Автор полагал, что индукция эндоплазматического ретикулума гепатоцитов, содержащего цитохромы, регулируется концентрацией в клетке свободного гема, высвобождающегося в ходе обменных процессов в эндоплазматическом ретикулуме. Гем взаимодействует с внутриядерным апорепрессором. При этом образуется репрессор, который в свою очередь угнетает геноператор. В тот момент, когда ген-оператор находится в неактивной форме, на соответствующем участке ДНК не осуществляется синтез мРНК, необходимой для синтеза энзиматических белков, входящих в структуру эндоплазматического ретикулума. При отсутствии свободного гема или в тех случаях, когда гем не может присоединиться к апорепрессору, происходит активация синтеза мРНК и выраженная пролиферация эндоплазматического ретикулума. Естественными ингибиторами образования репрессора и являются стероиды, активно взаимодействующие с апорепрессором. В соответствии с этой моделью около 300 ксенобиотиков (далеко не все структурные аналоги стероидов) способны избирательно взаимодействовать с апорепрессором и блокировать тем самым образование репрессора. Эти вещества проявляют свойства индукторов микросомальных ферментов. Кроме того, так как большинство индукторов являются, как и стероиды, жирорастворимыми веществами они активно захватываются мембранными структурами цитоплазмы гепатоцитов, вытесняя при этом из соответствующих сайтов связывания "депонированные" стероиды. Концентрация последних повышается в цитоплазме, а затем и в ядре клеток. Связывание с апорепрессором усиливается, активируется процесс синтеза энзимов метаболизма ксенобиотиков.

в соответствие с более поздними представлениями механизм действия стероидных гормонов, полициклических ароматических углеводородов, 2,3,7,8,-тетрахлордибензо-п-диоксина, состоит во взаимодействии с цитозольными рецепторными белками. Образующиеся комплексы мигрирует в ядро клетки, где вызывают дерепрессию регуляторных генов и, тем самым, активирует синтез того или иного энзима. В случае ТХДД такой рецепторный цитоплазматический протеин идентифицирован, по крайней мере, в гепатоцитах лини мышей, чувствительных к ароматическим углеводородам. Установлено, что синтез гидроксилазы ароматических улеводородов (aryl hydrocarbon hydroxylase) регулируется локусом единственного доминантного гена, Ah, и может быть усилен при введении ТХДД. Цитозольный белокрегулятор гена получил название Ah-рецепторный протеин.

Другие индукторы, такие как барбитураты, вероятно действуют с помощью иного механизма. Хотя известно, что в основе процесса также лежит индукция синтеза белка, до конца не выяснено каким образом клетка распознает индуктор и как осуществляется воздействие на процесс транскрипции. Индукторы класса фенобарбитала относятся к числу малоактивных соединений. Для реализации эффекта нужны дозы препаратов на несколько порядков превышающие эффективные дозы ТХДД. Рецепторный белок для фенобарбитала пока не идентифицирован.

Помимо усиления синтеза энзимов дополнительным механизмом индукции является стабилизация информационной РНК и белковых молекул в клетке.

6.3.1.3. Влияние индукторов на токсичность ксенобиотиков Достаточно часто усиление метаболизма ксенобиотиков приводит к снижению их токсичности. Так,

повторное введение фенобарбитала белым крысам самцам приводит к увеличению резистентности животных примерно в полтора раза к таким высоко токсичным ФОС, как зарин, зоман, ДФФ и др. Понижается чувствительность экспериментальных животных к цианидам. Вместе с тем токсичность других веществ, при этом, существенно возрастает. Например, усиливается гепаттоксическое действие алкалоида монокротолина и циклофосфамида, канцерогенная активность 2-нафтиламина. Вследствие индукции усиливается также токсичность четыреххлористого углерода, бромбензола, иприта и др.

Другим последствием индукции может быть изменение соотношения интенсивности метаболизма ксенобиотиков в разных органах и тканях, в результате чего основным органом биопревращения ксенобиотика у экспериментального животного, получавшего индукторы, становится иной орган, чем у интактных животных. Так, после введения крысам 3-метилхолантрена (индуктор) основным органом метаболизма 4-ипомеанола (токсичный дериват фурана) становятся не легкие (как в норме), а печень.

Индукторы из группы производных барбитуровой кислоты способны одновременно активировать синтез одних изоферментов (например, цитохромР-450 зависимых оксидаз) и угнетать активность других. В этой связи a priori трудно предсказать последствия влияния индукторов на токсичность ксенобиотиков.

У человека индукция микросомальных ферментов нередко становится следствием различных привычек (курение, прием алкоголя и т.д.), профессионального и экологического контакта с веществами (ПАУ, органические растворители, диоксины, галогенированные инсектициды и т.д.), длительного приема некоторых лекарств (барбитураты, антибиотики типа рифампицин и т.д.).

6.3.2. Угнетение активности энзимов Многие вещества способны угнетать активность ферментов, катализирующих метаболизм

ксенобиотиков.

Группа ингибиторов метаболизма включает:

- конкурентные ингибиторы ферментов (альтернативные субстраты). Например, этиловый спирт - ингибитор метаболизма метанола или этиленгликоля; никотинамид - угнетает N-деметилирование аминопирена и т.д.;

163

-неконкурентные ингибиторы. Это, как правило, алкилирующие агенты, угнетающие активность энзима, но не конкурирующие с субстратом. Например, метирапон является хорошо известным ингибитором монооксигеназных реакций биопревращения. К этой же группе относится вещество SKF-525 - известный ингибитор Р-450;

-"суицидные ингибиторы" - вещества, образующиеся в процессе метаболизма ксенобиотика при участии данного фермента и одновременно являющиеся его ингибиторами. Например, ингибиторами Р-450 такого рода являются дигидропиридины; метаболиты пиперонилбутоксида угнетают микросомальное окисление многих ксенобиотиков в печени, таких как альдрин, анилин, аминопирен, карбарил и др;

-реакционноспособные промежуточные метаболиты, ингибирующие активность энзимов нескольких типов в месте их образования: метаболиты четыреххлористого углерода, дихлорэтана и т.д.;

-ингибиторы синтеза кофакторов и простетических групп энзимов. К числу таких относятся, например, Со, блокирующий синтез гема, являющегося простетической группой цитохромР-450 зависимых оксидаз; вещества истощающие запасы глутатиона в клетках.

Ингибиторы ферментов метаболизма не нашли в настоящее время практического применения. Однако

вусловиях лаборатории для исследовательских целей некоторые из них используются достаточно часто (рисунок 16).

Рисунок 16. Некоторые ингибиторы метаболизма ксенобиотиков. В скобках указаны ингибируемые энзимы

Если ксенобиотик подвергается в организме детоксикации, угнетение его метаболизма приведет к повышению токсичности, если происходит биоактивация, токсичность вещества понижается. Например, дисульфирам (антабус), являясь ингибитором альдегиддегидрогеназы, вызывает резкое повышение содержания уксусного альдегида в крови и тканях человека принявшего этанол. Это сопровождается тошнотой, рвотой и другими симптомами, тягостно воспринимающимися пострадавшим. На этом эффекте основано практическое использование вещества для борьбы с алкоголизмом. Угнетение энзима необратимо и его активность восстанавливается в результате синтеза de novo. Идентичная ситуация складывается при отравлении грибами рода Coprinus. Через 3 - 6 часов после их приема развивается повышенная чувствительность к алкоголю, продолжающаяся до 3 суток. После приема алкоголя в течение 20 минут - 2 часов появляются тошнота, рвота, покраснение кожных покровов, резкая головная боль, тахикардия, снижение артериального давления. В тяжелых случаях возможна потеря сознания. Явления обусловлены тем, что в грибах содержится термостабильный токсин - протокоприн. В организме вещество превращается в коприн - мощный ингибитор альдегиддегидрогеназы.

Коканцерогенное действие некоторых соединений обусловлена их способностью угнетать процессы детоксикации канцерогенов. Так, пиперонилбутоксид (ингибитор Р-450) является коканцерогеном фреонов 112 и 113.

Наиболее простым методом выявления способности веществ влиять на метаболизм ксенобиотиков является опыт с определением продолжительности сна лабораторных животных, вызванного гексобарбиталом. Это вещество довольно быстро разрушается печеночными микросомальными энзимами и поэтому эффект может быть оценен в течение относительно короткого промежутка времени. Ингибиторы метаболизма, введенные до наркотического препарата, удлиняют продолжительность сна. Так, хлорамфеникол в дозах 5 - 200 мг/кг, при введении за 0,5 -1,0 ч до гексобарбитала дозо-зависимо увеличивает продолжительности сна мыши (в высоких дозах - десятикратно).

164

6.3.3. Двухфазный эффект: угнетение и индукция Многие ингибиторы микросомальных энзимов одновременно вызывают и их индукцию. Ингибирование,

как правило, процесс быстрый, состоящий в прямом взаимодействии ксенобиотика с энзимом. Индукция - пролонгированный во времени процесс. В этой связи нередко после действия вещества наблюдается период кратковременного снижения активности монооксигеназ, сменяющийся периодом относительно стойкого повышения их активности. Наиболее известным веществом, действующим подобным образом, является пиперонилбутоксид.

7. Активные метаболиты и их роль в инициации токсического процесса Многие ткани являются мишенью для повреждающего действия продуктов метаболизма некоторых

ксенобиотиков. Как правило, чем менее токсично вещество, то есть, чем большее его количество вызывает интоксикацию, тем выше вероятность того, что в основе инициации различных форм токсического процесса может лежать действие реактивных промежуточных продуктов метаболизма (рисунок 17).

(4,53кб, 560x228 GIF)

Рисунок 17. Роль метаболических превращений ксенобиотика в развитии различных форм токсического процесса

Некоторые вещества активируются уже в ходе однократного превращения, другие в результате многоэтапных превращений, локализующихся порой в разных органах и тканях. Одни метаболиты проявляют свое пагубное действие непосредственно в месте образования, другие способны мигрировать, производя эффект в других органах. Обычно рассматривают три модели механизмов, связывающих явление метаболизма ксенобиотиков и процессы формирования повреждения органов и систем.

Модель N1. Эта модель является наиболее простой (рисунок 18). Орган - мишень действия токсиканта содержит весь набор энзимов, необходимых для биоактивации ксенобиотика. В результате действия этих энзимов образуется реактивный метаболит, который и вызывает повреждение органа. Как правило, таким образом действуют чрезвычайно активные метаболиты, не способные к диффузии за пределы клеток, в которых они образовались (таблица 7).

Рисунок 18. Модель N1

Таблица 7. Классификация ксенобиотиков по способу их биотрансформации (модель N1)

165

*ПО - пероксидаза

NАТ - амин-N-ацетилтрансфераза СТ - сульфотрансфераза ФПР - флавопротеинредуктаза ЭГ - эпоксигидраза

Модель N2. Орган мишень не в состоянии биотрансформировать исходный токсикант в реакционноспособный метаболит, но может участвовать в биоактивации промежуточных продуктов, образовавшихся в других органах (рисунок 19). Эта модель применима к веществам, первично метаболизируемым в печени. Однако обязательным этапом их метаболизма является превращение в других органах, например кишечнике и т.д. Орган-мишень содержит энзимы, отсутствующие в печени, например, энзимы катаболизма конъюгатов глутатиона (почки), пероксидазы (почки, лейкоциты, костный мозг), некоторые подтипы цитохромР-450. Первичные метаболиты - химически инертные вещества, вторичные - обладают высокой реакционной способностью, достаточной для того, что бы вызывать повреждение органа в котором они образуются (таблица 8).

(3,49кб, 514x241 GIF)

Рисунк 19. Модель N2

Таблица 8 Классификация ксенобиотиков по способу их биотрансформации (модель N2)

168

Как следует из приведенных данных, значение величины объема вентиляции существенно сказывается на выведении веществ хорошо растворимых в крови (эфир), интенсивность кровотока в легких прежде всего влияет на скорость элиминации плохо растворимых в крови веществ (этилен, закись азота). Основываясь на представленных данных, можно решить, с помощью каких препаратов (дыхательных аналептиков или стимуляторов сердечной деятельности) можно ускорить выведение летучих и газообразных веществ из организма.

Через легкие из организма выделяются летучие анестетики, летучие органические растворители, фумиганты. Метаболизм некоторых органических соединений проходит с образованием СО2. Порой до 50% меченного радиоактивным изотопом соединения выделяется в форме 14СО2.

Другой способ легочной экскреции реализуется с помощью альвеолярно-бронхиальных транспортных механизмов. В просвет дыхательных путей секретируется жидкость, сурфактант, макрофаги, содержащие ксенобиотики. Секрет, а также адсорбированные на поверхности эпителия частицы аэрозоля, выводятся затем из дыхательных путей благодаря мукоцилиарному восходящему току. Более 90% частиц выводится таким образом из дыхательных путей в гортань в течение часа после ингаляции. Из гортани вещества поступают в желудочно-кишечный тракт.

2. Почечная экскреция Почки - важнейший орган выделения в организме. Через почки выводятся продукты обмена веществ,

многие ксенобиотики и продукты их метаболизма. Масса почек чуть менее 0,3% массы тела, однако, через орган протекает более 25% минутного объема крови. Благодаря хорошему кровоснабжению, находящиеся в крови вещества, подлежащие выведению, быстро переходят в орган, а затем и выделяются с мочой. В основе процесса выделение через почки лежат три механизма (рисунок 1):

-фильтрация через гломерулярно-капиллярный барьер;

-секреция эпителием почечных канальцев;

-реабсорбция клетками эпителия.

Через почки прокачивается около 700 мл плазмы крови в минуту, из которых 20% (125 - 130 мл/мин) отфильтровывается через гломерулярно-капиллярный барьер. Более 99% отфильтрованной жидкости реабсорбируется в почечных канальцах.

Рисунок 1. Механизмы, регулирующие процесс экскреции ксенобиотиков через почки. Фильтрация:

-все низкомолекулярные вещества, находящиеся в растворенном состоянии в плазме крови. Секреция:

-органические кислоты, мочевая кислота и т.д.;

-сильные органические основания, тетраэтиламмоний, метилникотинамид и т.д.; Реабсорбция:

-пассивная обратная диффузия всех жирорастворимых веществ;

-неионизированные молекулы органических кислот;

-активная реабсорбция глюкозы, лактата, аминокислот, мочевой кислоты, электролитов. 2.1. Фильтрация

Фильтрация осуществляется в почечных клубочках, при этом фильтрат преодолевает барьер, образованный эндотелием капилляров, формирующих клубочек, базальной мембраной и эпителием капсулы клубочка. Общая площадь поверхности более чем 1,7 - 2,5 миллионов клубочков обеих почек составляет около 2 - 3 м2.

Диаметр пор базальной мембраны составляет у разных видов млекопитающих 2 - 4 нм; общая площадь пор: 4 - 10% от общей фильтрационной поверхности (для сравнения в мышцах - 0,1%). Поры между эндотелиальными и эпителиальными клетками почечного клубочка равны 25 - 50 и 10 - 25 нм соответственно. Таким образом, почки работают как мощный ультрафильтр, задерживающий высокомолекулярные вещества и пропускающий все молекулы с малой и средней массой. Фильтрат содержит все составные части плазмы крови, имеющие размеры меньше, чем размеры фильтрующих пор базальной мембраны. Для молекул с молекулярной массой более 15000 возможности фильтрации существенно снижаются. Протеины плазмы крови (и связанные с ними низкомолекулярные вещества) не подлежат фильтрации. Для фильтрации через клубочковый аппарат почки жиро- и водо-растворимость веществ не является определяющим фактором.

Движущая сила фильтрации складывается из артериального давления в гломерулярных капиллярах, минус гидростатическое давление в боуменовой капсуле, минус коллоидно-осмотическое давление плазмы крови. Давление крови в гломерулярных капиллярах с помощью различных механизмов поддерживается на уровне 50 - 80 мм Hg. Эффективное фильтрационное давление в почках составляет около 8 мм Hg.

Скорость фильтрации зависит от ряда факторов и может увеличиваться при:

169

-повышении давления крови в гломерулярных капиллярах;

-уменьшении содержания белка, особенно альбумина, в плазме крови;

-понижении гидростатического давления в боуменовой капсуле;

-увеличении числа функционирующих гломерул.

В норме, благодаря наличию прегломерулярных анастомозов, существенная часть клубочков находится в неактивном состоянии. Их включение в процесс выделения существенно увеличивает интенсивность процесса фильтрации.

Поскольку белки плазмы крови не подлежат фильтрации, через почки выделяются лишь вещества, не связанные с белками. Поскольку свободная и связанная фракция ксенобиотика в крови находится в состоянии динамического равновесия, как только свободная часть отфильтровывается, связанная освобождается из связи с белками. Если связь прочная и высвобождение веществ затруднено процесс выделения вещества растягивается во времени.

Некоторые вещества практически полностью отфильтровываются в клубочках почек в течение нескольких часов. Так как в течение минуты фильтрации подвергается около 130 мл плазмы, скорость почечной элиминации веществ, выделяющихся исключительно посредством фильтрации можно рассчитать по формуле:

t1/2 = ln2 (VD/FR)

t1/2 - период полувыведения;

FR - скорость фильтрации (130 мл/мин); VD - объем распределения.

При различных объемах распределения период выведения фильтрующихся веществ будет существенно различен:

Если объем распределения вещества известен, то на основе величины периода полувыведения можно также судить, быстрее или медленнее элиминируется вещество, чем можно было бы ожидать, исходя из расчета скорости фильтрации плазмы. Если отличия существенны, следует думать о дополнительных механизмах выведения вещества через почки.

2.2. Канальцевая реабсорбция Гломерулярный фильтрат с растворенными в нем ксенобиотиками переходит из боуменовой капсулы

по извитым канальцам, петле Генле, дистальному отделу канальцев в собирательные трубки. Длина каждого из 2 млн канальцев равна 3 - 5 см. Общая площадь поверхности канальцев равна примерно 7 - 8 м2 (таблица 2).

Первичная моча (фильтрат плазмы крови) в значительной части распространяется по этой поверхности в виде тонкой пленки. Благодаря этому удается достичь высокой эффективности процесса диффузии через клеточный слой канальца. По своим свойствам первичная моча ни чем не отличается от сыворотки крови. Она содержит такую же концентрацию ксенобиотика, как и плазма. Следовательно, между жидкостями не существует градиента концентрации веществ. В различных отделах почечных канальцев (и уже в проксимальном их отделе) происходит активная обратная резорбция из первичной мочи отфильтрованной воды, а также многочисленных химических веществ. Из 130 мл первичной мочи в канальцах реабсорбируется 129 мл воды (99%). Это приводит к очень значительному повышению концентрации растворенных в моче веществ и среди них ксенобиотиков. Таким образом, формируется высокий градиент концентрации веществ между содержимым канальцев и плазмой крови. Именно он является движущей силой обратной диффузии веществ из первичной мочи в кровь. Процессу свободной диффузии препятствует барьер, формируемый эпителием канальцев, межуточным веществом и эндотелием капилляров, оплетающих стенку канальцев. В целом свойства этого барьера аналогичны свойствам гистогематических барьеров других тканей. Определяющей является проницаемость эпителия канальцев. Закономерности, определяющие процесс диффузии ксенобиотиков и их метаболитов через стенку канальцев, полностью идентичны описанным ранее. Реабсорбции, прежде всего, подвергаются: а) жирорастворимые вещества; б) неионизированные молекулы водо-растворимых веществ; в) вещества с низкой молекулярной массой.

Проницаемость канальцевого барьера почти тождественна проницаемости слизистой кишечника, поэтому вещества, легко всасывающиеся при приеме через рот, затем трудно выводятся через почки, так как легко реабсорбируются из первичной мочи обратно в кровоток, а затем обратно - из кровотока в первичную мочу. Такая длительная тубуло-гломерулярная рециркуляция веществ (как правило, хорошо растворимых в липидах) приводит к существенному замедлению процесса их элиминации. Метаболизм кскенобиотиков (см. выше) во многом и предназначен для превращения жирорастворимых (плохо выводящихся из организма) веществ в водо-растворимые, способные к выведению из организма, соединения.

170

Выделение через почки слабых кислот и оснований существенно зависит от рН мочи. Как уже указывалось, вещества могут подвергаться реабсорбции в том случае, если молекула их не ионизирована. Из этого следует, что при подкислении мочи (путем назначения хлористого аммония) слабые основания (например алкалоиды) будут переходит в ионизированную форму, хуже реабсорбироваться и лучше выводиться из организма. При подщелачивании мочи (например, путем приема соды), по той же причине, из организма лучше будут выводиться слабые кислоты (например, барбитураты).

Помимо пассивной диффузии некоторые веществ в канальцах подвергаются активной реабсорбции. К числу таких веществ относятся естественные метаболиты: лактат, глюкоза, мочевая кислота, которые после их фильтрации в первичную мочу, попадают обратно в кровь. Для ксенобиотиков этот механизм не имеет существенного значения.

2.3. Канальцевая секреция Многие органические кислоты (пробеницид, глюкурониды, салициловая кислота, пенициллин и т.д.)

быстро переходят из крови в мочу. В основе быстрого переноса таких соединений в просвет почечных канальцев лежит активный транспорт. Транспортные системы находятся в проксимальном отделе почечных канальцев. Этот процесс направлен против градиента концентрации вещества, является насыщаемым, зависит от интенсивности обмена веществ, конкурентно ингибируется веществами с близким строением. Так, пробеницид блокирует экскрецию пенициллина или р-аминсалициловой кислоты. Специфичность транспортных механизмов невелика. Условием переноса является наличие в молекуле групп СООНили SO3- и гидрофобного участка. Переносу подлежат соединения как простого, так и сложного строения. Связывание субстрата с молекулами-переносчиками осуществляется за счет ионных и водородных связей.

Иногда процессу активной секреции из крови в просвет канальцев противодействует простая диффузия вещества в противоположном направлении. Например, мочевая кислота с одной стороны активно секретируется, а с другой - пассивно диффундирует обратно в кровоток. Пробеницид в большей степени угнетает реабсорбцию вещества и поэтому при его введении наблюдается усиленная экскреция мочевой кислоты из организма.

В почечных канальцах существует система активного выведения и веществ со свойствами слабых оснований: тетраэтиламмония, алкалоидов (морфина, хинина), имипрамина, мекамиламина и др. Эта система не блокируется пробеницидом.

Механизмы активной секреции обнаруживаются у большинства позвоночных. 2.4. Совместное действие механизмов почечной экскреции

Количество отфильтрованного вещества в единицу времени можно рассчитать по формуле:

GFR Cp = V Cn , где

GFR - скорость гломерулярной фильтрации (мл/мин) Cp - концентрация вещества в плазме крови

Cn - концентрация вещества в моче V - объем мочи (мл)

Формула справедлива для веществ, не подвергающихся реабсорбции (например, для инулина с МВ - 5500). С помощью инулина можно оценить характеристики гломерулярной фильтрации. При достижении равновесного состояния концентрации веществ в плазме (Cp) имеем:

GFR = V Cn/Cp = Clин

Получаемая величина называется клиаренсом. Клиаренс (Cl) - это объем плазмы крови, очищаемой от токсиканта в единицу времени. В условиях клиники исследуют легко определяемый клиаренс инулина, по значению которого (129 мл/мин) можно судить о состоянии гломерулярной фильтрации.

При сравнении клиаренса инулина с клиаренсом других веществ могут быть получены три вида результатов (см. рисунок 2):

1.Clвещества/Clин = 1. Почечное выделение вещества осуществляется только путем гломерулярной фильтрации.

2.Clвещества/Clин < 1. Выделяется меньше вещества, чем отфильтровывается, т.е. возможна канальцевая реабсорбция.

3.Clвещества/Clин > 1. Выделяется больше вещества, чем отфильтровывается, т.е. возможна активная канальцевая секреция вещества.