95)Инактивация биогенных аминов
Накопление биогенных аминов может отрицательно сказываться на физиологическом статусе и вызывать ряд существенных нарушений функций в организме. Однако органы и ткани, как и целостный организм, располагают специальными механизмами обезвреживания биогенных аминов, которые в общем виде сводятся к окислительному дезаминированию этих аминов с образованием соответствующих альдегидов и освобождением аммиака:
Ферменты, катализирующие эти реакции, получили название моноамин-и диаминоксидаз. Более подробно изучен механизм окислительного дез-аминирования моноаминов. Этот ферментативный процесс является необратимым и протекает в две стадии:
R-CH2-NH2+ Е-ФАД + H20-> R-CHO + NH3+ Е-ФАДН2 (1)
Е-ФАДН2 +02-> Е-ФАД + Н202 (2)
Первая (1), анаэробная, стадия характеризуется образованием альдегида, аммиака и восстановленного фермента. Последний в аэробной фазе окисляется молекулярным кислородом. Образовавшаяся перекись водорода далее распадается на воду и кислород. Моноаминоксидаза (МАО), ФАД-содержащий фермент, преимущественно локализуется в митохондриях, играет исключительно важную роль в организме, регулируя скорость биосинтеза и распада биогенных аминов. Некоторые ингибиторы моно-аминоксидазы (ипраниазид, гармин, паргилин) используются при лечении гипертонической болезни, депрессивных состояний, шизофрении и др.
В организме человека подвергается распаду около 70 г аминокислот в сутки, при этом в результате реакций дезаминирования и окисления биогенных аминов освобождается большое количество аммиака, являющегося высокотоксичным соединением. Поэтому концентрация аммиака в организме должна сохраняться на низком уровне. Действительно, уровень аммиака в крови в норме не превышает 60 мкмоль/л (это почти в 100 раз меньше концентрации глюкозы в крови). В опытах на кроликах показано, что концентрация аммиака 3 ммоль/л является летальной. Таким образом, аммиак должен подвергаться связыванию в тканях с образованием нетоксичных соединений, легко выделяющихся с мочой.
96)Распад нк.
Полимерные молекулы нуклеиновых кислот расщепляются в тканях преимущественно гидролитическим путем при участии специфических ферментов, относящихся к нуклеазам. Различают эндонуклеазы, разрывающие внутренние межнуклеотидные связи в молекулах ДНК и РНК, вызывающие деполимеризацию нуклеиновых кислот с образованием олигонуклеотидов, и экзонуклеазы, катализирующие гидролитическое отщепление концевых мононуклеотидов от ДНК и РНК или олигонуклеотидов. Помимо гидролитических нуклеаз, имеются ферменты, катализирующие распад нуклеиновых кислот, например, посредством трансферазной реакции. Они катализируют перенос остатка фосфорной кислоты от 5'-го углеродного атома рибозы одного мононуклеотида ко 2'-му углеродному атому соседнего мононуклеотида, сопровождающийся разрывом межнуклеотидной связи и образованием фосфодиэфирной связи между 2'-м и 3'-м углеродными атомами рибозы одного и того же мононуклеотида. К настоящему времени открыты группы нуклеаз, катализирующие распад ДНК и РНК.
Дезоксирибонуклеазы I катализируют разрыв внутренних фосфодиэфир-ных связей в одной из двух цепей молекулы ДНК между 3'-м углеродным атомом дезоксирибозы и остатком фосфата с образованием низкомолекулярных олигодезоксирибонуклеотидов:
ДНК + (n–1) Н2O –> n-Олигодезоксирибонуклеотиды.
Среди продуктов реакции открыты также моно- и динуклеотиды. Типичными представителями этих ферментов являются ДНКазы поджелудочной железы. Одна из них (ДНКаза I) была получена в чистом виде, расшифрована последовательность всех ее 257 аминокислотных остатков. Фермент наиболее активен при рН 6,8–8,0, активируется двухвалентными ионами Mg2+и Мn2+ и ингибируется конечными продуктами ферментативной реакции – олигонуклеотидами.
Дезоксирибонуклеазы II вызывают деполимеризацию молекулы ДНК в результате парных разрывов фосфодиэфирных связей обеих цепей ДНК с образованием более крупных олигодезоксирибонуклеотидов. Представителем их является ДНКаза II, выделенная из селезенки, имеющая мол. массу 38000 и состоящая из 343 аминокислотных остатков. В составе этой ДНКазы открыт глюкозамин. Фермент также активируется ионами металлов, ингибируется анионами; его оптимум рН между 5,5 и 5,8.
Помимо этих ферментов, открыты (преимущественно у микроорганизмов) еще экзодезоксирибонуклеазы, гидролизующие фосфодиэфирные связи молекулы ДНК с отщеплением концевых 5'-дезоксирибонуклеотидов. Например, из E. coli выделено четыре таких фермента, обозначаемых экзодезоксирибонуклеазами I, II, III и IV.
Рестриктазы – ферменты ДНКазного типа действия – катализируют распад чужеродной (в основном фаговой) ДНК в строго определенных участках молекулы, имеющих структуру палиндромов. Из E. coli выделены и охарактеризованы две такие рестриктазы, обозначаемые EcoRI и EcoRII соответственно. Рестриктазы оказывают строго специфическое действие, поэтому они используются для расшифровки последовательности нуклео-тидных остатков в ДНК фагов и вирусов. Кроме того, это уникальное свойство рестриктаз находит все большее практическое применение в генетической инженерии при «вырезании» определенных фрагментов ДНК и «встраивании» их в геном бактериальной ДНК (получение рекомби-нантных ДНК). В результате клетке передается ряд не свойственных ей прежде наследственных признаков. Теоретическое и главным образом практическое значение подобных исследований трудно переоценить. Свидетельством огромного интереса к проблемам генетической инженерии является создание и успешное выполнение в институтах Российской АН и лабораторий ряда стран совместной комплексной программы – проекта «Рестриктазы».
Многие сотни рестриктаз выделены в очищенном состоянии и уже являются коммерческими препаратами.
Из ферментов, катализирующих гидролитический распад РНК, наиболее изучены рибонуклеазы I. Они гидролизуют фосфодиэфирные связи внутри молекулы РНК. Выделенная из поджелудочной железы многих животных РНКаза состоит из 124 аминокислотных остатков во всех случаях, хотя ферменты несколько различаются последовательностью аминокислотных остатков; выяснена также третичная структура ряда РНКаз (см. главу 4). Получен в гомогенном состоянии из плесневого гриба рода Aspergillus фермент гуанилрибонуклеаза, катализирующая эндонуклеолитическое расщепление РНК.
Из ферментов, осуществляющих распад ДНК и РНК не по гидролитическому пути, следует назвать полинуклеотид-фосфорилазу и группу ДНК-гликозидаз. В настоящее время подробно изучены физико-химические свойства и биологическая роль микробной полинуклеотид-фосфорилазы в лаборатории С.С. Дебова; в той же лаборатории фермент открыт в животных тканях.
Механизм действия фермента сводится к переносу нуклеотидных остатков с РНК на неорганический фосфат, при этом образуется рибо-нуклеотиддифосфат (РДФ):
Предполагают, что in vivo фермент катализирует распад клеточных РНК, преимущественно мРНК, до нуклеозиддифосфатов, участвуя тем самым в регуляции концентрации клеточного неорганического фосфата. Следует указать еще на одну не менее важную уникальную функцию полинуклеотид-фосфорилазы – способность фермента катализировать в опытах in vitro синтез из свободных нуклеозиддифосфатов (НДФ) поли-рибонуклеотидов с заданной последовательностью. Этот фермент сыграл выдающуюся роль в расшифровке кода белкового синтеза в лабораториях лауреатов Нобелевской премии С. Очоа и М. Ниренберга (см. главу 15).
Открыта группа ДНК-гликозидаз, участвующих в реакциях отщепления модифицированных пуриновых и пиримидиновых оснований (например, урацила, образующегося при дезаминировании остатка цитозина в одной из цепей ДНК).
В результате последовательного действия разнообразных клеточных экзо- и эндонуклеаз нуклеиновые кислоты подвергаются распаду до стадии рибо- и дезоксирибонуклеозид-3'- и 5'-фосфатов. Дальнейший распад образовавшихся продуктов связан с ферментативными превращениями моно-нуклеотидов , нуклеозидов и далее свободных азотистых оснований. На I этапе гидролиза действуют 3'- и 5'-нуклеотидазы, катализирующие гидролитический распад мононуклеотидов до свободных нуклеозидов с отщеплением неорганического фосфата соответственно от С-3' или С-5' атомов углеводного остатка. На II этапе происходит перенос остатка рибозы от нуклеозида на свободную фосфорную кислоту с образованием рибозо-1-фосфата и свободного азотистого основания.