Использование рекомбинантных ферментов

Создание рекомбинантных ферментов позволяет получать один и тот же фермент в достаточно больших количествах, которые могут быть использованы:

• для изучения свойств ферментов

• и для использования в различных областях – в диагностике, в промышленности, в других научных исследованиях, т.е. в качестве коммерческих продуктов.

Исследование ферментов с использованием методов генной инженерии

Генная инженерия открывает перед современной энзимологией огромные возможности для изучения свойств ферментов:

• возможность быстрого становления первичной структуры фермента и кодирующего его гена;

• выявления принципов формирования пространственной структуры белка (вторичной, супервторичной, третичной структур);

• изучение свойств и функции фермента in vivo и in vitro.

Получение рекомбинантных ферментов как коммерческих продуктов

При наличии эффективной системы экспрессии получение фермента может производиться очень эффективно. Рекомбинантые клетки становятся «фабриками» по производству определенного белка. В настоящее время микробиологическое производство рекомбинантных ферментов, также как и других белков, находит все более широкое применение. Из всех тысяч известных к настоящему времени ферментов лишь несколько десятков имеют прикладное значение – используются в промышленности. Использование ферментов в промышленных масштабах часто ограничено тем, что большинство ферментов быстро денатурирует при высокой температуре и действии органических растворителей, а именно в этих условиях протекают многие промышленные процессы. Для изменения свойств белков применяют генную инженерию.

Примером получения ферментов в качестве коммерческих продуктов может служить получение сайт-специфических эндонуклеаз.

Получение эндонуклеаз рестрикции

Сайт-специфические эндонуклеазы – рестриктазы – это ферменты, на которых базируется огромное число молекулярно-генетических методов. Их используют в генной инженерии для создания рекобринантных ДНК, в молекулярно диагностике наследственных заболеваний человека, научных исследованиях. В настоящее время в продаже предлагается более 300 различных рестриктаз. Все эти ферменты синтезируются самыми разнообразными микроорганизмами: аэробными, анаэробными, термофильными и т.д. Для культивирования каждого из них понадобилось бы подбирать оптимальные условия ферментации – температуру, рН, состав среды, концентрацию кислорода. Получения рестриктаз использовались природные бактериальные штаммы, то это бы требовало огромных усилий по созданию оптимальных условий для большого разнообразных микроорганизмов и много времени для подбора оптимальных условий. Создание рекомбинантных штаммов E.coli, несущих гены рестриктаз позволило стандартизировать условия получения необходимых продуктов. Кроме того, культура E.coli быстро достигает высокой плотности и может быть приспособлена для сверхпродукции необходимого фермента. Методы получения рестриктаз из рекомбинантных систем намного более эффективны, чем выделение этих ферментов из природных исходных микроорганизмов.

Технология экспрессии чужеродных генов а E.coli и некоторых других микроорганизмах хорошо отработана, однако синтез гетерологичного белка в организме-хозяине может оказывать на него негативное влияние. Например, сверхпродукция такого белка может привести к истощению метаболических ресурсов хозяйских клеток и отрицательно повлиять на их рост и даже оказаться губительным для клетки-хозяина. Так, сайты рестрикции имеются во всех молекулах ДНК и, если продуктом клонированного гена является эндонуктеаза рестрикции, то в отсутствие специальных защитных механизмов хозяйская ДНК будет расщепляться ею. Природные микроорганизмы, синтезирующие эндонуклеазы рестрикции имеют защитный механизм, состоящий в том, что в них существуют системы модификации-рестрикции (в паре с рестриктазой действует метилаза и метилированные сайты не расщепляются).

Подход к решению проблемы деградации хозяйской ДНК гетерологичной эндонуклеазой состоит в клонировании и экспрессии в реципиентном организме кроме гена рестриктазы гена парной ему метилазы. При создании таких рекомбинантных систем преодолеваются такие сложности как то, что гены рестриктазы и метилазы могут находиться не рядом, а в разных местах исходного генома; метилирующий фермент должен синтезироваться в клетке до расщепляющего.

Получение ферментов – лекарственных препаратов

В настоящее время быстро развивается использование рекомбинантных ферментов для ферменто-заместительной терапии, в частности для лечения наследственных энзимопатий. Такие заболевания являются достаточно редкими и развитие методов их лечения стало возможным именно благодаря развитию методов генной инженерии. Один из мировых лидеров в этой области – фирма «Genzyme», которая производит рекомбинантные ферменты для лечения муковисцидоза, мукополисахаридозов, сфинголипидозов.

Метаболические пути, созданные методами генной инженерии

В настоящее время предложено создание генно-инженерных систем не просто экспрессирующих отдельные рекомбинантые ферменты, но систем, включающих несколько рекомбинантых ферментов и даже небольшой метаболический путь. Такая задача стала особенно актуальной с развитием молекулярной биотехнологии. Так, усилия по созданию искусственных метаболических путей направлены на создание систем биодеградации ксенобиотиков. Некоторые микроорганизмы обладают природной способностью к деградации различных ксенобиотиков, однако эти природные способности имеют определенные ограничения для использования в промышленных масштабах. Микроорганизмы обладают способностью разрушать только определенные ксенобиотики; биодеградация часто происходит довольно медленно; в большинстве очагов загрязнения содержится смесь ксенобиотико и микроорганизмы, способные разрушать одни вещества, могут инактивироваться другими.

Задача создания искусственного метаболического пути может решаться двумя путями:

• объединением нескольких рекомбинантных ДНК в одной клетке;

• объединением нескольких генов в одной рекомбинантной ДНК.

Объединение плазмид

Эксперименты по созданию бактериальных штаммов обладающих широкими катаболическими возможностями заключаются в переносе в клетки плазмид, каждая из которых кодирует фермент, расщепляющий определенный класс углеводородов – камфары, октана, нафталина, ксилола. Такие «супербациллы» успешно создаются. Так, был получен штамм, который растет на неочищенной нефти лучше исходных штаммов, взятых по отдельности или вместе.

Объединение нескольких генов в одной рекомбинантной ДНК

Работы по созданию генно-инженерных систем для утилизации тех или иных субстратов позволяют объединять в рамках одной рекДНК нескольких генов, кодирующих ферменты расщепления этого субстрата. При этом эти гены могут быть как бактериального, так и животного и растительного происхождения. Таким образом может быть создан метаболический путь, который не существует в природе.

Одним из примеров может служить создание рекомбинантного штамма E.coli, синтезирующего краситель индиго. Этот краситель широко используется в текстильной промышленности, в частности для окрашивания джинсовой ткани и является одним из самых востребованных красителей. В экспериментах по соединению в одной рекомбинантной системе генов утилизации нафталина, толуола и фенола удалось получить штамм, который окрашивался в синий цвет. Оказалось, что рекомбинантный штамм способен синтезировать индиго из триптофана в 4 стадии. Таким образом, этот неожиданный результат был получен объединением 2-х метаболических путей.

Создание рекомбинантных микроорганизмов с новой ферментативной активностью

Основной целью создания рекомбинантных микроорганизмов с новой ферментативной активностью, способного превращать существующий субстрат в ценный продукт, который ранее получали только сочетанием микробиологического и химического синтеза. Например, производство L-аскорбиновой кислоты (витамина С), синтез аминокислот, антибиотиков, микробиологического синтеза каучука и других веществ.

Производство L-аскорбиновой кислоты (витамина С) – трудоемкий процесс, включающий микробиологическую и химическую стадии. Биохимические исследования показали, что одни бактерии могут превращать глюкозу в 2,5-дикетоглюконовую кислоту (Erwinia, Acetobacter, Gluconobacter), а другие (Corynebacterium) могут превращать 2,5-дикетоглюконовую кислоту в кетогулоновую, т.к. экспрессирует соответствующую редуктазу. Создание рекомбинантного штамма позволило объединить два метаболических пути в одном: ген редуктазы дикетоглюконовой кислоты из Corynebacterium был клонирован и применен для трансформации клеток Erwinia .