Смешанный тип ингибирования

Типы ингибирования, рассмотренные выше, являются предельными случаями в широком спектре возможных эффектов. В случае двусубстратных реакций, при определенной концентрации ингибитора, часто можно наблюдать ингибирование смешанного типа.

Общая схема ингибирования смешанного типа.

При этом Ki₁ ≠ Ki₂. Изменяются как константа Михаэлиса, так и максимальная скорость, но не в одинаковой степени:

(8)

Смешанное конкурентное-неконкурентное ингибирование. В этом варианте ингибирования Ki₂˃ Ki₁. Сродство фермента к субстрату в присутствии ингибитора данного типа увеличивается, а максимальная скорость ферментативной реакции снижается (2.3.14).

, (9)

Рис. 2.3.14. Смешанное конкурентное-неконкурентное

Смешанное неконкурентное-бесконкурентное ингибирование. В этом случае Ki₁ ˃ Ki₂. Этот ингибитор снижает и константу Михаэлиса и максимальную скорость реакции (рис. 2.3.15).

, (10)

Рис. 2.3.15. Смешанное неконкурентное-бесконкуоентное.

Примером смешанного ингибирования является воздействие ртутьорганического соединения мертиолата на сахаразу грибов. Это вещество широко используется в промышленности для подавления роста микромицетов.

Субстратное ингибирование

Для многих ферментативных реакций при увеличении концентрации субстрата начальная скорость ферментативной реакции проходит через максимум, а затем уменьшается. Подобного рода зависимость можно описать, исходя из предположения об образовании в процессе реакции непродуктивного тройного комплекса ЕS₂. В этом случае кинетическая схема ферментативной реакции выглядит следующим образом:

Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата после математической обработки этой схемы имеет вид:

(11)

Где К^′_s – субстратная константа, учитывающая сродство фермента ко второй молекуле субстрата. Анализ этого уравнения, как и уравнения Михаэлиса-Ментен, целесообразно проводить раздельно в области низких ([S] < К_s^´) и высоких ([S] ˃ К_m ) концентрациях субстрата.

При низких значениях концентрации субстрата уравнение упрощается до классического уравнения Михаэлиса-Ментен (рис. 2.3.16а), при линеаризации которого можно определить К_m, V_max, k_cat (k₊₂ ).

В области высоких концентраций субстрата уравнение принимает вид:

(12)

Линеаризация этого уравнения в координатах (1/v, [S]) позволяет определить V_max и К_s^´ (рис.2.3.16б).

а) б)

Рис. 2.3.16. Линеаризация уравнения (12) в координатах (1/v 1/[S]) –а) и (1/v ; [S]) – б)

Зная величины К_m и К_s^´, можно рассчитать оптимальную концентрацию субстрата по формуле:

(13)

Методы определения константы ингибирования. Метод Диксона

Величины К_i можно измерить различными методами, как экспериментально, так и при помощи расчетов.

Если известна только одна концентрация ингибитора, то константу ингибирования можно определить, используя графики в координатах Лайнуивера-Берка. Найдя кажущиеся и истинные значения константы Михаэлиса и максимальной скорости для двух графиков (в отсутствии и в присутствии ингибитора) и подставив эти значения в формулы (2), (4), (7), (9), (10).

Наиболее удобен для определения константы ингибирования метод Диксона. Этот простой графический метод позволяет определять Кi непосредственно. Если определять скорость реакции в условиях постоянной концентрации субстрата и различных концентраций ингибитора, то график зависимости 1/v от [I] будет представлять собой прямую (рис. 2.3.17).

Рис. 2.3.17. Графическое определение ингибиторных констант (метод Диксона). Во всех случаях S₁˃S₂

В этом случае для определения ингибиторной константы достаточно определить скорость реакции всего для двух концентраций субстрата.