Лекция 2.2. Стационарная кинетика ферментативный реакций

В изучении свойств ферментов, а также решении ряда научно-исследовательских и практических задач биохимии, биофизики, микробиологии и биотехнологии ведущая роль отводится ферментативной кинетике. Опираясь на знания таких параметров ферментативной кинетики, как константа Михаэлиса (Км) и максимальная скорость реакции (Vmax), исследователи получают важную информацию не только о сродстве изучаемого фермента к субстрату, но и о возможности использования его в практических целях.

В ферментативной кинетике концепция стационарности применима к к концентрациям связанных с ферментом интермедиатов. Когда фермент смешивается с избытком субстрата наблюдается начальный период, известный как предстационарное состояние, в течение которого концентрации этих интермедиатов достигают стационарного уровня. По достижении интермедиатами стационарных концентраций скорость реакции относительно медленно изменяется со временем и именно в данный период традиционно измеряют скорости энзиматических реакций. Стационарное состояние является аппроксимацией, поскольку субстрат постепенно превращается в ходе эксперимента. Но, принимая во внимание, что измерения осущесвляются за короткий промежуток времени, когда концентрация субстрата изменяется незначительно, стационарное состояние является хорошей аппроксимацией. Хотя изучение предстационарной кинетики позволяет анализировать механизмы ферментативного катализа, стационарная кинетика более важна для измерения каталитической активности фермента при стационарных состояниях в клетке.

Уравнение Михаэлиса-Ментен

Впервые А. Браун (Brown A.J.) и затем В.Анри (Henri V.) в начале ХХ века высказали предположение о том, что в основе ферментативной реакции лежит обратимое взаимодействис субстрата с ферментом с образованием комплекса, который далее распадается с образованием продуктов реакции и регенерацией исходного фермента. Эта гипотеза была далее развита в работах Михаэлиса (L. Michaelis) и Ментен (M.L. Menten) (1913 г.) и позднее – Бригсом (G.E. Briggs) и Холденом (J.B.S. Haldane) (1925 г.).

Кинетическую схему простейшей односторонней ферментативной реакции превращения одного субстрата в продукт можно представить следующим образом:

(1)

Ферментативная реакция протекает в два этапа. На первом этапе фермент и субстрат образуют фермент-субстратный комплекс ES. Этот этап является быстрым и обратимым, он не сопровождается какими-либо химическими изменениями субстрата. Константы скорости реакции образования фермент-субстратного комплекса и обратного его распада равны соответственно k₊₁ и k_-1. В образовании фермент-субстратного комплекса (ФСК, комплекс Михаэлиса) принимают участие нековалентные взаимодействия.

Каталитический процесс осуществляется на втором этапе реакции с константой первого порядка k₊₂ (k_cat, число оборотов фермента). Комплекс Михаэлиса распадается с образованием конечного продукта реакции Р и регенерацией исходного фермента. Распад фермент-субстратного комплекса может происходить по-разному: в данной кинетической схеме он распадается в одну стадию, но в других случаях этих стадий может быть несколько.

Исходя из уравнения (1), можно расписать уравнения для скоростей отдельных стадий реакции.

Скорость образования фермент-субстратного комплекса:

.

Скорость обратной реакции (диссоциации комплекса на исходные вещества):

.

Скорость распада комплекса ES с образованием продуктов реакции и регенерацией фермента:

.

Стационарное течение процесса возможно тогда, когда концентрация субстрата существенно превосходит концентрацию фермента ([S]>> [E]). В этом случае распад комплекса ES по реакциям (+2) и (-1) уравновешивается его образованием по реакции (+1). Поэтому для условия стационарности можно записать:

или

.

Обозначив общую концентрацию фермента через [E]₀, при условии, что [E]₀ = [E] + [ES], преобразуем предыдущее уравнение

.

Откуда концентрация фермент-субстратного комплекса будет равна

.

Обозначив

,

Получим

.

Скорость ферментативной реакции, измеряемая согласно схеме (1) по образованию продукта реакции Р из комплекса ES, может быть выражена следующим образом

.

Подставляя в это выражение найденное значение [ES], получим

(2)

Данное уравнение отражает зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации фермента и субстрата. Константа Км носит название константы Михаэлиса и имеет размерность концентрации субстрата. Уравнение (2) свидетельствует, что зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата при [E]₀=const является гиперболической функцией (рис. 2.2.1).

Рис.2.2.1. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата

Кривая представляет собой равнобочную гиперболу. При достаточно малых концентрациях субстрата, когда [S] << Км, можно принять, что Км + [S] ≈ Км и тогда

V = k₊₂[E]₀, [S]/ Км,

поэтому реакция имеет первый порядок по отношению к субстрату и является линейной функцией концентрации субстрата.

Когда [S] = Км, скорость реакции является полумаксимальной, т.е. v= 1/2 Vmax. В области высоких значений концентрации субстрата, когда [S] >> Км, можно принять, что Км + [S] ≈ [S], и тогда

v ≈ k₊₂[E]₀ = Vmax,

а реакция имеет нулевой порядок по отношению к субстрату. Следовательно, при достижении определенной концентрации субстрата скорость ферментативной реакции достигает максимального значения Vmax и при дальнейшем увеличении концентрации субстрата не изменяется.

Смысл такого рода зависимости очевиден: скорость ферментативной реакции определяется в целом концентрацией фермент-субстратного комплекса и при малых концентрациях субстрата концентрация комплекса Михаэлиса пропорциональна [S], тогда как при избытке субстрата фактически весь фермент находится в форме ES. Дальнейшее повышение концентрации субстрата не приводит к увеличению [ES].

С учетом приведенного выше выражения, окончательное уравнение зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации фермента и субстрата приобретает вид

(3)

.

Уравнение (3) является фундаментальным уравнением ферментативной кинетики и обычно называется уравнением Михаэлиса-Ментен.

Скорость реакции приближается к максимальной достаточно медленно, и даже при [S]= 10Км, величина скорости достигает только 0,91 Vmax. В связи с этим значение максимальной скорости очень часто трудно измерить и его приходится рассчитывать из скоростей, наблюдаемых при концентрациях субстрата ниже насыщающих.

Согласно уравнения (3), скорость реакции при данной концентрации субстрата линейно зависит от концентрации фермента. В случае значительного числа ферментативных реакций это наблюдается в действительности. На рис. 2.2.2 приведен пример зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации фермента.

Рис. 2.2.2. Зависимость скорости от концентрации фермента

Линейный характер этой зависимости, наблюдающийся в достаточно широком интервале [E]₀, не будет меняться до тех пор, пока соблюдаются условие существенного превышения концентрации субстрата над концентрацией фермента. При значительном повышении концентрации фермента будет наблюдаться отклонение от линейной зависимости и при некоторой концентрации фермента дальнейшего повышения скорости реакции происходить не будет, что обусловлено отсутствием достаточного количества свободного субстрата. В связи с этим при изучении влияния различных концентраций фермента необходимо, как и всегда, определять начальную скорость ферментативной реакции, когда глубина превращения субстрата незначительна и его концентрация остается достаточно высокой (соблюдается условие [S]>> [E]₀).

В тех же случаях когда при соблюдении условия [S]>> [E]₀ не наблюдается линейной зависимости между скоростью реакции и общей концентрацией фермента, для описания кинетики фермента нельзя применять уравнение Михаэлиса-Ментен.