Техника измерения.

Оптическое вращение измеряют с помощью поляриметра. Луч источника света (натриевой или ртутной лампы) при прохождении через поляризатор - призму Николя или пленки - поляризуется в плоскости. Поляризованный свет пропускается через кювету с веществом и попадает в анализатор (тоже призма Николя). Если плоскость поляризации обеих призм расположены друг относительно друга под прямым углом, то поляризованный свет в отсутствии оптически активного вещества через анализатор не проходит. Чтобы поляризованный свет не проходил через анализатор после помещения в прибор оптически активного вещества, анализатор необходимо повернуть на некоторый угол вправо или влево. Этот угол и представляет собой и наблюдаемое оптическое вращение, которое затем пересчитывается в удельное _или молярное вращение_.

Приборы.

1. Поляриметр круговой см-2.

Основная погрешность поляриметра в диапазоне измерений от 0 до ±35° составляет ±0,04°. Источник света – лампа ДНАС 18-04.2 (натриевая лампа, основная линия излучения (D) равна 589,3 нм). Измерения следует начинать не ранее чем через 10 минут после включения лампы поляриметра.

2. Автоматический поляриметр фотоэлектронный а1-епо.

Основная погрешность измерений от 0 до ±25º составляет ±0,01º. Измерения следует начинать не ранее чем через 30 минут после включения прибора. Источником света служит натриевая лампа.

Оборудование.

1. Набор кювет 25 мм (2,5 мл); 50 мм (5 мл); 100 мм (10 мл). На трубке кюветы отгравирована ее фактическая длина в мм между торцами.

2. Две контрольные поляриметрические кварцевые пластинки, предназначенные для проверки поляриметра, на них также отгравированы фактические углы вращения, а именно –21,137º и +21,250º.

3. Аналитические весы ВЛР-200.

4. Пипетки, колбы.

Растворы и реактивы.

Способы выражения концентрации

Молярность (М) - количество молей растворенного вещества содержащегося в 1 литре раствора.

Массовый процент (с) - количество граммов растворенного вещества содержащегося в 100 г раствора.

Эмпирическая зависимость между концентрациями, с учетом изменения плотности раствора от концентрации, исходя из данных (Справочник химика. 2-е изд. Л.Химия, 1964. Т.3. с.575.) для 20^оС, выглядит следующим образом

Сахароза М = 0,0291745 х + 0,000110479 х²+ 0,000000496462 х³(0 - 20 масс.%)

Глюкоза М = 0,0554168 х + 0,000208617 х²+ 0,000000847472 х³(0 - 30 масс.%)

Рабочее задание.

1. Ознакомиться с прибором - поляриметром, измеряющим угол поворота плоскости поляризации образца. Понять сущность его работы.

2. Обнаружить вращение плоскости поляризации у выданных растворов. Продемонстри-ровать линейную зависимость между углом поворота и концентрацией оптически активного вещества. Определить неизвестную концентрацию.

Порядок выполнения работы.

1) Определение нулевого отсчета производят в кювете, наполненной дистиллированной водой. Следует следить за отсутствием пузырей воздуха на пути светового луча. В случае работы на СМ-2, вращением втулки наблюдательной трубки устанавливают окуляр по глазу на резкое изображение линии раздела полей сравнения. После этого поворачивают анализатор и добиваются равенства яркостей полей сравнения в чувствительном положении.

Измерение следует повторить не менее 5 раз и вычислить среднее арифметическое. Полученное значение является нулевым отсчетом.

2)Провести измерения с двумя контрольными поляриметрическими кварцевыми пластинками. Поправка на температуру, отличную от стандартной в 20 °С, рассчитывают по формуле: _D^t=_D²⁰[1 + 0,000143(t– 20)]

где t– установившаяся рабочая температура в измерительной камере, °С.

_D²⁰– значение угла вращения кварцевой пластинки при температуре 20 °С,

град.

: _D^t– значение угла вращения кварцевой пластинки при рабочей температуре,

град.

После введения поправки на нулевой отсчет следует убедиться в правильности работы прибора.

3)Приготовить стандартные растворы (сахар или L-лизин). Для этого необходимо на аналитических весах взвесить пустую колбу, поместить в нее около 1 г вещества и взвесить, добавить еще 10 мл воды (или 5 мл при использовании кювет длиной в 50 мм) и опять взвесить. Взбалтыванием раствора добиться полного растворения (раствор должен быть прозрачным), рассчитать массовую концентрацию – с. Изготовить подобным образом второй раствор из 0,5 г вещества.

4)Заполнить кюветы стандартными растворами, провести измерения. Поскольку угол вращения плоскости поляризации прямо пропорционален длине кюветы и концентрации оптически активного вещества, то при использовании одинаковых кювет можно построить линейный калибровочный график зависимости угла вращения как функцию концентрации раствора = f(с), проходящий через начало координат.

5) Заполнить кювету раствором с неизвестной концентрацией. Провести измерения и по углу вращения с помощью графика определить неизвестную концентрацию.

Контрольные вопросы.

1. Что обозначает термин «хиральность». L,D и R,Sклассификация для белков и углеводородов.

2. Могут ли вещества быть оптически активными, если у них отсутствует асимметричный атом углерода?

3. Живые организмы усваивают L-аминокислоты и D-углеводы. Почему в природе не накапливаются D-аминокислоты и L-углеводы? Какие живые организмы используют D-аминокислоты?

4. Атом азота в аммонийных основаниях [NR₁R₂R₃R₄]⁺ассиметричен. Почему основания [NR₁R₂R₃Н]⁺обычно не проявляют хиральных свойств, чем это вызвано?

5. Что такое мутаротация, где в настоящей работе она встречается?

6. Сколько оптических изомеров образует НООССН(ОН)СН(ОН)СООН - винная кислота? Объясните.

7. Зависимость показателя преломления среды от частоты световых волн.

8. Что такое фазовая и групповая скорость световых волн? Их зависимость от частоты света.

9. Рассеяние Томпсона и Рэлея.

10. Пространственная и временная когерентность световых волн.

11. Определение возраста человека по измерению оптической активности биомолекул.

12. Пределы измерения доз ионизирующей радиации методом определения оптической активности.

13. Поляризованность света в природе. Четвертьволновые пластины и поляроидные пленки.

14. От чего зависит угол поворота плоскости поляризации поляризованного света при прохождении через раствор, содержащий оптически активные биомолекулы?

15. Способы измерения оптической активности биомолекул.

16. Определение конформации белка методами ДОВ и КД.

Список литературы.

1. Фейнман Р. Фейнмановские лекции по физике. – М.: Мир, т.3-4.

2. Волькенштейн М.В. Биофизика. – М.:Наука,1981.

3. Моррисон Р., Бойд Р. Органическая химия. М.Мир,1974.

4. Фрайфелдер Д. Физическая биохимия. М.Мир, 1980.

5. Маршелл Э. Биоорганическая химия. . М.Мир,1981

Приложение 1. Свойства L--аминокислот

Название	Химическая структура	Сокращенное обозначение (рекомендуемое ИЮПАК)	Молярное вращение раствора в 5 н HCl [MD24-26]	Изоэлектрическая точка pI	pK
Моноаминомонокарбоновые кислоты
Глицин	СН2(Н2)СООН	Gly (G)	-	5,97	2,34 (COOH) 9,6 (NH2)
Аланин	СН3СН(Н2)СООН	Ala (A)	13,0	6,00	2,34 (COOH) 9,6 (NH2)
Аминомасляная (некодируемая геномом)	СН3СН2СН(Н2)СООН	Abu	21,2	5,98
Валин	(СН3)2СНСН(Н2)СООН	Val (V)	33,1	5,96	2,32 (COOH) 9,69 (NH2)
Норвалин (некодируемая геномом)	СН3(СН2)2СН(Н2)СООН В белках отсутствует	Nva	28,2	5,97 (6,04)	2,36 (COOH) 9,72 (NH2)
Лейцин	(СН3)2СНСН2СН(Н2)СООН	Leu (L)	21,0	5,98 (6,04)	2,36 (COOH) 9,6 (NH2)
Норлейцин (некодируемая геномом)	СН3(СН2)3СН(Н2)СООН	Nle	32,1	6,08	2,39 (COOH) 9,76 (NH2)
Изолейцин	СН3СН2СН(СН3)СН(Н2)СООН	Ile (I)	58,8	5,94 (6,02)	2,32 (COOH) 9,76 (NH2)
Фенилаланин	С6Н5СН2СН(Н2)СООН	Phe (F)	-7,4	5,48 (5,91)	2,58 (COOH) 9,24 (NH2)
Моноаминодикарбоновые кислоты
Аспарагиновая	НООССН2СН(Н2)СООН	Asp (D)	33,8	2,77	1,88 (COOH) 3,65 (COOH) 9,6 (NH2)

Глутаминовая	НООС(СН2)2СН(Н2)СООН	Glu (E)	46,8	3,22 (3,08)	2,19 (COOH) 4,25 (COOH) 9,67 (NH2)
Аспарагин (амид)	H2NCOСН2СН(Н2)СООН	Asn (N)	37,8	5,41	2,02 (COOH) 3,8 (NH2)
Глутамин (амид)	H2NCO(СН2)2СН(Н2)СООН	Gln(Q)	46,5 (1н HCl)	5,65	2,17 (COOH) 9,13 (NH2) 5,65 (NH2)
Диаминомонокарбоновые кислоты
Орнитин (некодируемая геномом)	H2N(СН2)3СН(Н2)СООН в организме играет важную роль (биосинтез мочевины)	Orn	37,5	9,70 (9,74)	1,94 (COOH) 8,65 (2NH2) 10,76 (5NH2)
Лизин	H2N(СН2)4СН(Н2)СООН	Lys (K)	37,9	9,59 (9,74)	2,18 (COOH) 8,95 (NH2) 10,5 (NH2)
Аминокислоты
Аргинин	HN=С(Н2)NH(CH2)3СН(Н2)СООН	Arg (R)	48,1	11,15 (10,76)	2,18 (COOH) 9,09 (NH2) 13,2 (гуанидин)
Гидроксиаминокислоты
Серин	СН2(ОН)СН(Н2)СООН	Ser (S)	15,9	5,68	2,21 (COOH) 9,15 (NH2)
Треонин	СН3СН(ОН)СН(Н2)СООН	Thr (T)	-17,9	5,64 (6,16)	2,71 (COOH) 9,62 (NH2)
Тирозин	п-НОС6Н4СН2СН(Н2)СООН	Tyr(Y)	-21,5 (1 н HCl)	5,66 (5,63)	2,2 (COOH) 9,11 (NH2) 10,07 (OH)
Тиоаминокислоты
Цистеин	СН2(SH)СН(Н2)СООН	Cys (C)	7,9	5,02 (5,07)	1,71 (COOH) 8,33 (NH2) 10,78 (SH)
Цистин (некодируемая геномом)	S2[СН2СН(Н2)СООН]2 Формирование пространственной структуры белков	(Cys)2	-530 (1 н HCl)	5,03	1,0 (COOH) 2,1 (COOH) 8,02 (NH2) 8,71 (NH2)
Метионин	СН3S(CH2)2СН(Н2)СООН	Met (M)	34,6	5,74	2,28 (COOH) 9,21 (NH2)
Гетероциклические аминокислоты
Пролин	N COOH H	Pro (P)	-69,5	6,30	1,99 (COOH) 10,6 (NH2)
Гидроксипролин (некодируемая геномом)	HO N COOH H	Hyp	-66,2	5,74
Гистидин	N CH2CH(NH2)COOH N H	His (H)	18,3	7,47 (7,6)	1,77 (COOH) 9,00 (NH2) 6,0 (имидазол)
Триптофан	H CH2CH(NH2)COOH	Trp (W)	13,0 (1 н HCl)	5,89	2,38 (COOH) 9,39 (NH2)

H₃NCH₂COOH + H⁺  H₃NCH₂COO^-  H₂NCH₂COO^- + H⁺

Кислота рК=2,34 цвиттер-ион основание рК=9,6

[H⁼][HA]=4,57·10^-3[H₂A⁺] [H⁺][A^-]=2,51·10^-10[HA]

Приложение 1. Соотношение митохондриальной, хлоропластной и ядерной ДНК в различных типах клеток.

Вид	Размер ядерной ДНК		Митохондриальная (как правило кольцевые ДНК)				Хлоропластная (как правило кольцевые ДНК)
	Длина (число нуклеотидных пар)	Число хромо-сом	Число митохондрий в клетке	Размер одной митох. ДНК в нуклеотидных. парах.	Число копий ДНК в мито-хондрии	Доля митохон. ДНК	Число хлоро-пластов в клетке	Размер одной хлороп.. ДНК в нукл. парах.	Число копий в хлоропласте	Доля хлоропл. ДНК
Дрожжи S.cereevisiae	2,7·107(106- 107)	32	22 (1 – 50)	84000 (7000 – 84000)	4 (2 – 50)	до15 – 18 %	-	-	-	-
Зеленые водоросли chlamydomonas	1,6·1010 2,7·1010		1	16000 (линейная ДНК)٭			1	180000	80	7 %
Высшие растения (вегетативные клетки)	Голосемянные 1,6·1010 Покрытосемянные 2,7·1010			150000 - 2500000			10 - 30	120000 –200000 (около 120 генов)		Около 10%
Лук	3·1010	16
Кукуруза, листья	1010	2 0					20 - 40	400000	20 - 40	15%
Махорка, ткань							1000
Е.gracilis							15	135000	40	3%
Животные				16000 - 19000		Менее 1%
Бабочка Lesandranivescens		380 -382
Крысы, печень			1000		5 - 10	1%
Мыши, клетки L-линия	6·109	40	100 - 500	16200	2 (5 – 10)	0,2% Менее 1%	-	-	-	-
Лягушки, яйцеклетки	3·109-180·109	18 - 28	107		5 - 10	99%
Человек	5,8·109	46	200 печень	16569 37 генов (22-тРНК, 2-рРНК, 13 белков)٭		Менее 1%
Ооцит (развивающая яйцеклетка)			300000
Человек,Неlа	5,8·109	46	800	16600	10	1%

٭) 50 генов из ядерной ДНК управляют экспрессией митохондриальных генов. В скобках указаны вариации для разных штаммов.

Таблица

Cвойства пуриновых и пиримидиновых оснований

Основа-ние	Сокращенное обозначение	Форма молекулы	макс, нм	макс.10	рК
Цитозин	C	Катион	275	10,03	4,5 – 4,7 12,1 – 12,3
		Нейтральная	268	6,09
		Анион	283	8,09
Урацил	U	Нейтральная	258	8,20	9,35 – 9,50 13,9
		Моноанион	282	5,90
		Дианион	273	7,17
Тимин	Т	Нейтральная	265	7,90	9,9 13,9
		Моноанион	293	5,19
		Дианион	280	5,97
Аденин	А	Дикатион	265	10,95	0,1 4,1 9,1
		Катион	265	13,16
		Нейтральная	260	13,32
		Анион	270	13,26
Гуанин	G	Катион	250	11,49	3,2 9,3 12,5
		Нейтральная	245	10,88
		Моноанион	275	8,24
		Дианион	273	10,20