Эритроциты

Экстракт можно легко получить из осажденных центрифугированием эритроцитов после промывания их изотоническим раствором NаС1 (0,9%, 0,15 М) и повторного центрифугирования. Клетки разрушают осмотическим шоком в воде (2 объема воды на 1 объем отцентрифугированных клеток). Около 90% белка, переходящего в раствор, составляет гемоглобин.

Мягкие растительные ткани

К растительной ткани добавляют только 0,5 - 1 объем холодного буфера, содержащего 20 - 30 mМ меркаптоэтанола и гомогенизируют в течение 30 с. Вместо этого можно пропустить материал через бытовую соковыжималку, предварительно промытую буфером. Гомогенат следует отцентрифугировать как можно скорее, чтобы уменьшить его потемнение в результате окисления (2·10⁵— 3·10⁵ g·мин). Жидкость осторожно сливают с поверхности осадка. При необходимости для адсорбции фенолов полезно добавить порошкообразный поливинилпирролидон.

Дрожжи

1. Полностью разрушить клетки можно с помощью гомогенизатора Мэнтона—Гаулина (Gaulin Corp. Mass.) или мельницы «Vibrogen Cell Mill» (Вühler, Тübingen), используя около двух объемов буфера на 1 г сырой массы.

2. Автолиз толуолом. Применяют различные методы с ис­пользованием толуола ; однако не все они пригодны для работы с коммерческими дрожжами. В основе этих методов лежит обработка дрожжей толуолом, обычно при температуре 35—40 °С. Через 20—30 мин дрожжи «разжижаются» вследствие экстракции компонентов клеточной стенки. После этого к дрожжам добавляют буфер и перемешивают их в течение нескольких часов или оставляют на ночь на холоде. Так как метод автолитический и структуры клеточной стенки разрушаются под действием ферментов, во время обработки может произойти деградация некоторых клеточных ферментов. Вместо толуола можно использовать этилацетат, но он не годится для работы со штаммами дрожжей, имеющими более прочные клеточные стенки.

Бактерии

Бактериальные клетки можно разрушить ультразвуком, с помощью шаровой мельницы или пресса Френча, хотя не все эти способы удобны для приготовления больших объемов экстракта. В случае небольших объемов клетки можно растирать с окисью алюминия. Грамположительные бактерии обычно чувствительны к лизоциму.

ПРИБОРЫ И ОБОРУДОВАНИЕ.

1. Водяная баня или термостат.

2. Центрифуга.

3. Весы лабораторные.

4. Холодильник.

5. Сосуд Дьюра с жидким азотом.

6. Ледяная баня (t= 0 – 4 ^oC).

РАСТВОРЫ И РЕАКТИВЫ.

1. Лизирующий буфер: 0,1 М ТРИС·НСl, 0,1 М ЭДТА, 0,3 М NaCl; рН=8,1.

2. 10%-ный раствор додецилсульфата натрия (SDS).

3. Раствор 10 SSС: 1,5 М NaCl, 0,15 М цитрати натрия; рН=7,2.

4. Смесь хлороформа с изоамиловым спиртом в соотношении 24:1.

5. Этанол.

6. 4 М NaCl.

ХОД РАБОТЫ.

Процедура выделения днк.

1. Растительный материал промыть водопроводной водой, высушить на фильтровальной бумаге, взвесить 5-10 г. Измельчить и растереть в фарфоровой чашке в жидком азоте до мелкого гомогенного порошка.

2. Порошок переносят в лизирующий буфер из расчета на 1 г измельченного материала 1-2 мл буфера.

3. Добавить в суспензию 10%-ный раствор додецилсульфата натрия до его конечной концентрации 2%. Образуется вязкий лизат.

4. Лизат прогреть 10 мин при температуре порядка 60 ^оС (при этом инактивируются нуклеазы).

5. Суспензию перенести в ледяную баню (t=0-4 ^оС) и все дальнейшие операции провести на холоде.

6. Добавлением 4 М NaCl довести концентрацию NaCl в суспензии до 1 М. Добавить равный объем смеси хлороформа с изоамиловым спиртом (24:1). Встряхивать (осторожно!) до полной гомогенизации раствора.

7. Раствор центрифугировать 10 мин в центрифуге при 1000 об/мин. Осторожно отсосать прозрачную водную фазу. (см.Рис.) Процедуру повторить 2-3 раза. Отобранную водную фазу объединить. Затем к отобранному раствору осторожно по стенке добавить 2 объема этилового спирта. ДНК при этом выпадает в осадок. Отцентрифугировать осадок при 5000 об/мин в течение 5 мин или намотать преципитат ДНК на стеклянную палочку. Выделенную ДНК растворить в 0,01 SSС.

8. После растворения переосадить ДНК еще раз этанолом (двумя объемами). Снова растворить в 0,01 SSС. Для длительного хранения перевести раствор ДНК в 1 SSС.

9. Провести тестирование нативности и молекулярного веса ДНК в соответствии с указаниями лабораторных работ №2 и №3.

Рис.2. Распределение компонентов смеси после встряхивания со смесью хлорофма с изоамиловым спиртом и центрифугирования.

І - водный слой, содержащий ДНК.

ІІ - промежуточный слой.

ІІІ – хлороформ.

ІV – осадок.

I

II

III

.