ПОВРЕЖДЕНИЕ - такие изменения структуры, обмена веществ и физико-химических свойств клеток, которые ведут к нарушению жизнедеятельности.

Все многообразные причины, которые вызывают повреждение клетки можно разделить на следующие основные группы: физические, химические и биологические.

 

1. Физические.

 

- Механические воздействия обуславливают нарушение структуры плазмолеммы и мембран субклеточных образований;

- колебания температуры. Повышение температуры может привести в денатурации белка, нуклеиновых кислот, декомпозиции липопротеидных комплексов, повышению проницаемости клеточных мембран. Снижение температуры может вызвать существенные замедление или необратимое прекращение реакций обмена во внутриклеточной жидкости и разрыв мембран.

- изменения осмотического давления. Его повышение сопровождается набуханием клетки, растяжением ее мембраны вплоть до разрыва. Снижение осмотического давления ведет к потере жидкости, сморщиванию и нередко к гибели клетки.

- воздействие ионизирующей радиации обуславливает образование свободных радикалов и активацию перекисных свободнорадикальных процессов, продукты которых повреждают мембраны и денатурируют ферменты клеток.

 

2. Химические.

 

Органические и неорганические кислоты, щелочи, соли тяжелых металлов, продукты нарушенного метаболизма, лекарственные препараты. Так, цианиды подавляют активность цитохромоксидазы. Соли мышьяка угнетают пируватоксидазу. Передозировка строфантина приводит к подавлению активности K⁺-Na⁺-АТФ-азы сарколеммы миокардиоцитов и т.д.

 

3. Биологические.

 

Вирусы, риккетсии, микробы, паразиты, грибки. Продукты их жизнедеятельности вызывают расстройства функций клеток, нарушают течение в них метаболических реакций, проницаемость и целостность мембраны, подавляют активность клеточных ферментов.

 

 

1. Расстройство процессов энергетического обеспечения клеток.

a) Снижение интенсивности процессов ресинтеза АТФ;

b) Нарушение транспорта АТФ;

c) Нарушение использования энергии АТФ;

2. Повреждение мембран и ферментов клеток.

a) Интенсификация свободнорадикальных реакций и свободнорадикального перекисного окисления липидов (СПОЛ);

b) Активация гидролаз (лизосомальных, мембраносвязанных, свободных);

c) Внедрение амфифильных соединений в липидную фазу мембран и их детергентное действие;

d) Перерастяжение и разрыв мембран набухших клеток и их органелл;

e) Торможение процессов ресинтеза поврежденных компонентов мембран и (или) синтеза их заново;

3. Дисбаланс ионов и жидкости.

a) Изменение соотношения отдельных ионов в гиалоплазме;

b) Изменения трансмембранного соотношения ионов;

c) Гипер- и гипогидратация;

4. Нарушение генетической программы клеток или механизмов ее реализации.

a) Нарушение генетической программы.

i) Изменение биохимической структуры генов;

ii) Дерепрессия патогенных генов;

iii) Репрессия “жизненноважных” генов;

iv) Внедрение в геном чужеродной ДНК с патогенными свойствами;

b) Нарушение механизмов реализации генетической программы.

i) Расстройства митоза:

a) повреждение хромосом;

b) повреждение структур, обеспечивающих течение митоза;

c) нарушение цитотомии.

ii) Нарушение мейоза.

5. Расстройство механизмов регуляции функций клеток.

a) Нарушение рецепции регуляторных воздействий.

b) Нарушение образования вторичных посредников (цАМФ, цГМФ)

c) Нарушение на уровне метаболических реакций.

 

 

1. Нарушение энергетического обеспечения процессов, протекающих в клетках может происходить на этапах синтеза АТФ, транспорта и утилизации его энергии.

Синтез АТФ может быть нарушен в результате дефицита кислорода, субстратов метаболизма, снижения активности ферментов тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования, гликолиза, повреждения и разрушения митохондрий. Известно, что доставка энергии АТФ к эфферентным структурам осуществляется с помощью ферментных систем: АДФ-АТФ-транслоказы (адениннуклеотидтрансферазы) и креатинфосфокиназы (КФК). Адениннуклеотидтрансфераза обеспечивает транспорт энергии макроэргических фосфатной связи АТФ из матрикса митохондрий через их внутреннюю мембрану, а КФК переносится далее на креатин с образованием креатинфосфата, который поступает в цитозоль. КФК эффекторных клеточных структур транспортирует фосфатную группу креатинфосфата на АДФ с образованием АТФ, который и используется в процессах жизнедеятельности. Указанные ферментные системы транспорта энергии также могут быть повреждены различными патогенными агентами, в связи с чем на фоне высокого содержания АТФ в клетке может развиться его дефицит в энергорасходующих структурах.

Нарушение энергообеспечения клеток и расстройство их жизнедеятельности может развиться в условиях достаточной продукции и нормального транспорта энергии АТФ. Это может быть результатом повреждения ферментных механизмов утилизации энергии, главным образом за счет снижения активности АТФ-аз (АТФ-азы актомиозина, K⁺-Na⁺-зависимой АТФ-азы плазмолеммы, Mg^2+-зависимой АТФ-азы “кальциевой помпы” саркоплазматического ретикулума и др.)

2. Повреждение мембрагн и ферментов играет существенную роль в нарушении жизнедеятельности клетки. Одной из важнейших причин таких изменений являются свободно-радикальные реакции (СРР) и перекисное окисление липидов (ПОЛ). Эти реакции протекают в клетках и в норме, являясь необходимым звеном таких жизненноважных процессов, как транспорт электронов в цепи дыхательных ферментов, синтез простагландинов и лейкотриенов, пролиферация и созревание клеток, фагоцитоз, метаболизм катехоламинов.

Интенсивность ПОЛ регулируется соотношение факторов, активирующих (прооксиданты) и ингибирующих (антиоксиданты) этот процесс. К числу наиболее активных прооксидантов относятся легко окисляющиеся соединения, индуцирующие свободные радикалы, в частности, нафтохиноны, витамины А и Д, восстановители - НАДФН2, НАДН2, липоевая кислота, продукты метаболизма простагландинов и катехоламинов.

Процесс ПОЛ условно можно разделить на следующие этапы:

1) кислородной инициации (“кислородный” этап), 2) образование свободных радикалов (”свободнорадикальный” этап), 3) продукции перекисей липидов (“перекисный” этап) Инициальным звеном свободнорадикальных перекисных реакций при повреждении клетки является образование в процесса оксигеназных реакций активных форм кислорода: супероксидного радикала кислорода (О₂-), гидроксильного радикала (ОН-), перекиси водорода (Н₂О₂), которые взаимодействуют с различными компонентами структур клеток, главным образом с липидами, белками и нуклеиновыми кислотами. В результате образуются активные радикалы, в частности липидов, а также их перекиси. Реакция может приобрести цепной “лавинообразный” характер. Однако, в клетках действуют факторы, ограничивающие свободнорадикальные и перекисные реакции, т.е. оказывают антиоксидантный эффект. В нижеприведенной таблице представлены ферментные и неферментные механизмы антиоксидантной защиты.

ЗВЕНЬЯ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ И ЕЕ НЕКОТОРЫЕ ФАКТОРЫ

 

Звенья антиоксидантной системы	Факторы	Механизмы действия
1. “антикислородное”	ретинол, каротиноиды, рибофлавин	уменьшение содержания О2 в клетке путем активации его утилизации, повышения сопряжение процессов окисления и фосфорилирования
2. “антирадикальное”	супероксиддисмутаза, токоферолы, маннитол	перевод активных радикалов в “нерадикальные” соединения, “гашение” свободных радикалов органическими соединениями
3. “антиперекисное”	глутатионпероксидаза, каталаза, серотонин	инактивация гидроперекисей липидов.

 

Чрезмерная активация свободнорадикальных и перекисных реакций, а также несостоятельность системы антиоксидантной защиты является одним из главных факторов повреждения мембран и ферментов клеток. Ведущее значение при этом имеют следующие процессы:

1) изменение физико-химических свойств липидов мембран, что обуславливает нарушение конформации их липопротеидных комплексов и соответственно снижение активности ферментных систем, обеспечивающих рецепцию гуморальных воздействий, трансмембранный перенос ионов и молекул, структурную целостность мембран;

2) изменение физико-химических свойств белковых мицелл, выполняющих структурную и ферментативную функции в клетке; 3) образование структурных дефектов в мембране - простейших каналов (кластеров) вследствие внедрения в них продуктов ПОЛ. Так накопление липидных гидроперекисей в мембране приводит к их объединению в мицеллы, создающие трансмембранные каналы проницаемости, по которым возможен неконтролируемый ток катионов и молекул в клетку и из нее, что сопровождается нарушением процессов возбудимости, генерации регулирующих воздействий, межклеточного взаимодействия и др. вплоть до фрагментации мембраны и гибели клетки.

В норме состав и состояние мембран и ферментов модифицируется не только свободнорадикальными и липоперекисными процессами, но также и лизосомальными ферментами, как свободными (солюбилизированными) так и мембраносвязанными: липазами, фосфолипазами, протеазами. Под действием различных патогенных факторов их активность или содержание в гиалоплазме может резко возрасти (например: вследствие ацидоза, способствующего повышению проницаемости лизосомальных мембран). В результате этого глицерофосфолипиды и белки мембран, а также ферменты клеток подвергаются интенсивному гидролизу. Это сопровождается значительным повышением проницаемости мембран и снижением кинетических свойств ферментов.

В результате действия гидролаз (главным образом липаз и фосфолипаз) в клетке накапливаются свободные жирные кислоты и лизофосфолипиды, в частности, глицерофосфолипиды: фосфатидилхолины, фосфатидилэтаноламины, фосфатидилсерины. Эти амфифильные соединения способны проникать и фиксироваться как в гидрофобной, так и в гидрофильной средах мембран. Внедряясь в биомембраны, они изменяют нормальную структуру липопротеиновых комплексов, увеличивают проницаемость, а также меняют конфигурацию мембран в связи с “клинообразной” формой липидных молекул. Накопление в большом количестве амфифильных соединений ведет к формированию в мембранах кластеров и появлению микроразрывов.

3. Дисбаланс ионов и жидкости в клетке.

Нарушение трансмембранного распределения и внутриклеточного содержания и соотношения различных ионов развивается вследствие или одновременно с расстройствами энергетического обмена и сочетается с признаками повреждения мембран и ферментов клеток. Как правило, дисбаланс ионов проявляется накоплением в клетке натрия и потерей калия вследствие нарушения работы K,Na-зависмой АТФ-азы плазмолеммы, увеличением содержания кальция, в частности, в результате расстройства функционирования натрий-кальциевого ионообменного механизма клеточной мембраны, который обеспечивает обмен двух ионов натрия, входящих в клетку, на один ион кальция, выходящий из нее. Увеличение внутриклеточного содержания Na+, конкурирующего с Са2+ за общий переносчик, препятствует выходу кальция из клетки. Нарушение трансмембранного распределения катионов сопровождается также изменением содержания в клетке анионов Cl^-, НCО₃^- и др.

Следствием дисбаланса ионов является изменение мембранного потенциала покоя действия, а также нарушение проведения импульса возбуждения. Нарушение внутриклеточного содержания ионов обуславливает изменение объема клеток вследствие дисбаланса жидкостей. Он проявляется либо гипергидратацией (отеками), либо гипогидратацией (уменьшение содержания жидкости) клетки. Так, повышение содержания ионов натрия и кальция в поврежденных клетках сопровождается увеличением в них осмотического давления, что приводит к накоплению в них воды. Клетки набухают, объем их увеличивается, что сопровождается растяжением и нередко микроразрывами цитолеммы и мембран органелл. Дегидратация клеток (например при некоторых инфекционных заболеваниях, обуславливающих потерю воды) характеризуется выходом из них жидкости и растворенных в ней белков и др. органических и неорганических водорастворимых соединений. Внутриклеточная дегидратация нередко сочетается со сморщиванием ядра, распадом митохондрий и др. органелл.

Механизмы увеличенного поступления Са2+ внутрь клеток Увеличенный приток Са2+ в клетку может происходить как через поврежденную, так и через неповрежденную мембрану. Причем в первом случае его концентрация в клетке значительно нарастает, что является характерным признаком погибающей клетки. При относительно небольших мембранных повреждениях возможно формирование особых каналов, ионофоров, через которые ионы Са2+ могут поступать внутрь клетки, способствуя ее гибели. Если целостность мембран не нарушена, то Са2+ попадает в клетку через 3 вида каналов: ♦ хемочувствительные Са2+ - каналы, которые могут быть открыты специальными фармакологическими препаратами; ♦ быстрые потенциал-зависимые Са2+-каналы, которые открываются лишь на короткий срок перезарядки мембраны; ♦ медленные потенциал-зависимые Са2+-каналы, которые открыты постоянно за счет подпороговой деполяризации клеточной мембраны. В условиях гиперкальциемии, а также при нарушении внутриклеточных процессов при воспалении, гипоксии поступление избыточного количества Са2+ в клетку связано именно с медленными каналами. Причины нарушения удаления кальция из клетки В основе этих нарушений лежит повреждение энергозависимых мембранных насосов. 1. Повреждение Са2+-насосов, связанное с отсутствием фермента Са2+-зависи-мой АТФ-азы и/или недостатком АТФ. В первом случае это наблюдается при наследственной патологии, во втором случае при: • гипоксии; • голодании; • нарушении активности ферментов цикла Кребса и дыхательной цепи; • разобщении процессов окислительного фосфорилирования; • нарушении транспорта АТФ из митохондрий креатинфосфатной транспортной системой. 2. Нарушения в работе Na+- Ca2+ обменного механизма. Дело в том, что для нормальной функции Са2+-насосов клетке необходим определенный градиент концентрации ионов натрия по обе стороны мембраны. Работа же Na+ - K+-Hacoca, обеспечивающего этот градиент, требует большого количества энергии (молекул АТФ). Уменьшение количества АТФ в клетке, помимо изложенных выше причин, может быть связано с действием целого ряда веществ, например, таких, как тетродотоксин, сердечные гликозиды и др. 3. Нарушение Са2+ - аккумулирующей функции митохондрий. Это сопровождается ограничением транспорта Са2+цитоплазмы в митохондриальный пул, что приводит к нарастанию количества Са2+ в клетке. Чаще всего к этому приводят следующие причинные факторы: • гиперфункция клетки, сопровождающаяся повышенным расходом АТФ; • тканевая гипоксия; • уменьшение внутриклеточного осмотического давления, действие солей тяжелых металлов. Все это дает картину неспецифического набухания митохондрий. Механизмы повреждения клетки кальцием Избыток Са2+ в клетке вызывает следующие нарушения ее структуры и функции. 1. Нарушаются специализированные функции клетки, так как осуществление рабочих циклов (например, генерация потенциалов действия, сокращение) требует своевременного выведения Са2+ из клетки. В противном случае клетка не способна ответить на очередной стимул, она будет находиться в рефрактерном состоянии. 2. Происходит активирование мембранных фосфолипаз, в частности фосфо-липазы-А2. Она отщепляет от фосфолипидов мембран повышенное количество ненасыщенных жирных кислот. Оставшиеся фосфолипиды, обладающие детергентными свойствами, формируют отрицательно заряженную мицеллу, нарушающую целостность мембран. 3. Может наблюдаться разобщение процессов окислителного фосфорилирования. 4. Могут изменяться свойства важнейших белковых комплексов клетки, в состав которых входят ионы Са2+ (кальмодуллин, тропонин-С, кальций-свя-зывающий белок энтероцитов, парвальбумин и др.). 5. Накопление во внутриклеточном пространстве ионов Са2+ приводит к запиранию хлорных каналов, что существенно нарушает мембранный электрогенез. 

4. Повреждение генетической программы или механизмов ее реализации.

К основным процессам, ведущим к изменению генетической информации клетки относятся мутации, дерепрессия патогенных генов (например онкогенов), подавление активности жизненноважных генов или внедрение в геном фрагмента чужеродных ДНК с патогенными свойствами.

Помимо изменений в генетической программе, важных механизмом расстройства жизнедеятельности клеток является нарушение реализации этой программы, главным образом в процессе клеточного деления при мейозе или митозе. Выделяют три группы нарушений митоза:

1. Изменения в хромосомном аппарате

2. Повреждения структур, обеспечивающих процесс митоза

3. Нарушение деления цитоплазмы и цитолеммы (цитотомии).

5. Расстройства регуляции внутриклеточных процессов.

Это может быть результатом нарушений, развивающихся на одном из следующих уровней регуляторных механизмов:

1. На уровне взаимодействия БАВ (гормонов, нейромедиаторов и др.) с рецепторами клетки. Изменение чувствительности, числа и конформации молекул рецептора, его биохимического состава ли липидного окружения в мембране может существенно модифицировать характер клеточного ответа на регулирующий стимул;

2. На уровне клеточных “вторичных посредников” (мессенджеров) нервных влияний в роли которых выступают циклические нуклеотиды - аденозинмонофосфат (цАМФ) и гуанозинмонофосфат (цГМФ) м которые образуются в ответ на действие “первых посредников” - гормонов и нейромедиаторов.

3. НА уровне метаболических реакций, регулируемых циклическими нуклеотидами или другими внутриклеточными факторами.

НЕКРОБИОЗ (от греческ. nekros—мертвый и bios—жизнь), термин, введенный в 1847 г. Вирховым для обозначения того вида местной смерти ткани и отдельных клеток, когда умирание их происходит не сразу, как при быстро наступающем некрозе (см.), а путем постепенного перехода от жизни к смерти. Это характерное для Н. постепенное умирание тканевых элементов имеет в основе различные атрофические и дегенеративные процессы, к-рые при прогрессирующем развитии могут в конце-концов привести тканевые элементы к смерти. Чаще всего Н. бывает связан с простыми атрофиями, различными дегенерациями и пат. инфильтрациями тканевых элементов, особенно же с различными видами белкового и жирового перерождения их; точно так же имеют значение (хотя и меныйее) нарушения обмена солей, расстройства в распределении и образовании пигментов и все экзогенные отложения, если эти расстройства связаны с понижением клеточной жизнедеятельности и прогрессирующей деструкцией. Вышеуказанные процессы, нередко обозначаемые как некробиотические, не обязательно приводят тканевые элементы к смерти, а могут с прекращением действия вызвавшей их вредной причины подвергаться обратному развитию, причем тканевые элементы переходят мало-по-малу в ортобиотическ. состояние (ортобиоз—нормальная жизнь). Мор-фологич. и физико-химнч. характеристика Н.—см. Атрофия, Белковое перерождение, Вакуольное перерождение, Гиалиновое пере-рождепие, Дегенерация, Жировое перерождение, Мутное набухание, Пигментация, Слизистое перерождение. При всех этих процессах признаком наступившей смерти клетки является исчезновение ядра ее путем кариолиза или кариорексиса.

Некро́з (от греч. νεκρός — мёртвый), или омертве́ние — это патологический процесс, выражающийся в местной гибели ткани в живом организме в результате какого-либо экзо- или эндогенного её повреждения. Некроз проявляется в набухании, денатурации и коагуляции цитоплазматических белков, разрушении клеточных органелл и, наконец, всей клетки. Наиболее частыми причинами некротического повреждения ткани являются: прекращение кровоснабжения (что может приводить к инфаркту, гангрене) и воздействие патогенными продуктами бактерий или вирусов (токсины, белки, вызывающие реакции гиперчувствительности, и др.).

Коагуляционный некроз развивается при низкой активности гидролитических процессов, высоком содержании белков и умеренном содержании жидкости в тканях. Некротизированная ткань имеет плотную и сухую консистенцию. Примером могут служить восковидный или ценкеровский некроз мышц при брюшном и сыпном тифе; фибриноидный некроз при аллергических и аутоиммунных заболеваниях. Разновидностью коагуляционного некроза является казеозный (творожистый) некроз, получивший своё название за сходство по консистенции, цвету и виду с творогом. Он развивается при таких заболеваниях как туберкулёз, сифилис, проказа и лимфогранулематоз. Химический анализ некротических тканей выявляет в них большое количество липидов.

Колликвационный некроз (от лат. colliquatio — разжижение, расплавление) — тип некроза, при котором консистенция мёртвой ткани дряблая, содержит большое количество жидкости, подвергается миомаляции. Колликвационный некроз развивается в тканях, богатых жидкостью, с высокой активностью гидролитических ферментов, например очаг серого размягчения головного мозга.

Микроскопическая картина при таком некрозе значительно отличается в зависимости от органа и ткани в котором происходит данный патологический процесс. При этом следует отличать от колликвационного некроза влажную гангрену. Которая макроскопически его напоминает, но при её развитии разжижение мертвой ткани происходит вторично, из-за колонизации её гноеродными бактериями. В процессе некроза происходит массивный кариорэксис, что приводит к более интенсивной окраске пораженной ткани гематоксилином, однако подобная патологическая реакция происходит не во всех случаях.

Клинические признаки некроза развиваются довольно быстро, в первые сутки у больного наблюдается коллатеральная гиперемия, сохраняющееся довольно долгое время. Вокруг некротизированной ткани формируется воспалительный вал, ткань инфильтрируется полиморфноядерными нейтрофилами. Так же растет концентрациягистоцитов и макрофагов. Все эти иммунные клетки предназначены для уничтожения и сорбции некротического очага. После того как очаг санирован, то тканевой дефект закрывается вторичным натяжением. Как правило формируется соединительно-тканный рубец, исключением является некроз тканей способных к полной регенерации.

Наряду с насильственной гибелью клеток, возникающей под действием повреждающих факторов, выделяют также ненасильственную (естественную) гибель клеток, обозначаемую как программированную гибель. Под программированностью такой гибели подразумевают наличие в клетке определенных программ суицида, которые включаются: в ответ на инволюцию (дегенеративные изменения) клеток; в ответ на активный сигнал смерти, передаваемый секретируемыми или мембраносвязанными цитокинами (инструктивный механизм гибели); в ответ на повреждение ДНК, а также в ответ на неполноценность сигналов, активирующих клетки. При этом термин «дегенерация» в современном понимании означает такое изменение структуры или химического состава ткани (либо органа), при котором снижается их жизнеспособность и ухудшается функционирование [31]. Каждая из этих программ отличается инициальными (запускающими) механизмами, однако терминальные механизмы их реализации однотипны. Конкретным же проявлением такой запрограммированной гибели клеток в случае включения любой программы являются апоптоз (гибель клеток 1 типа) и аутофагия (гибель клеток 2 типа).

апоптоз представляет собой активную форму гибели клеток, сопровождающуюся уменьшением их объема и сморщиванием, а на молекулярном уровне – деградацией ДНК, потерей трансмембранного потенциала митохондрий, уплотнением мембран и рядом других характерных изменений. Апоптоз не является синонимом понятия «программированная клеточная гибель» (хотя именно в таком контексте этот термин чаще всего употребляется). Программированная гибель – это определение точки запуска механизмов клеточной гибели и определенная реализация этих механизмов, а апоптоз – форма проявления такой гибели.

С биологических позиций апоптоз представляет собой физиологический механизм (альтернатива пролиферации), направленный на элиминацию невостребованных, функционально неполноценных, поврежденных и трансформированных клеток, а также клеток, представляющих угрозу аутоагрессии. Этот процесс, который наблюдается в условиях как нормальной, так и патологической жизнедеятельности позвоночных и безпозвоночных животных. Он имеет место в различных тканях млекопитающих и реализуется в нормальном онтогенезе, тератогенезе, канцерогенезе, при терапевтически обусловленной регрессии новообразования.

Программированная гибель клетки, формой проявления которой выступает апоптоз, является активным процессом, требующим затрат энергии и синтеза макромолекул (РНК, белка) de novo.

Особенность апоптотической гибели состоит и в том, что в нее клетки вовлекаются постепенно и таким образом лишь отдельные клетки в пределах клеточной популяции в данный момент принимают участие в этом процессе.

Апоптоз – это форма гибели клетки, сопровождающаяся уменьшением ее размеров, конденсацией и фрагментацией хроматина, уплотнением наружной и цитоплазматической мембран без выхода содержимого клетки в окружающую среду и, соответственно, без развития перифокального воспаления.

Следствием апоптотической гибели клеток служит образование т.н. апоптозных телец – мембранных пузырьков с клеточным содержимым, поглощаемых впоследствии макрофагами и соседними клетками.

Главным проявлением апоптоза является деградация хроматина.

Показатели	Апоптоз	Некроз
Пусковой фактор	Сигналы, воспринимаемые геномом, мембранными рецепторами или цитозольными белками, а также отсутствие сигналов	Повреждение клетки или ее структур
Направленность процесса	Физиологическая	Патологическая
Характер гибели	Естественный	Насильственный
Наличие программы реализации механизмов гибели клеток	Есть	нет
Регуляция процесса гибели клеток	Геномная, клеточная, иммунная, нейроэндокринная	Отсутствует
Потребность в энергии	Есть	Нет
Необходимость синтеза РНК и белка при реализации клеточной гибели	Есть	Нет
Субстрат первичных структурных нарушений	Ядро	Мембраны клетки
Скорость развития	1-12 часов	В пределах 1 часа
Вовлеченность клеток	Единичные, постепенно	Многочисленные, одномоментно
Изменение ядра	Конденсация хроматина	Набухание
Изменение цитоплазмы	Конденсация и уплотнение гранул	Набухание и лизис гранул
Изменение размера клеток	Сморщивание	Набухание
Проницаемость мембран	Снижена	Повышена
Выход содержимого клетки во внеклеточное пространство	Отсутствует	Имеет место
Перифокальное воспаление	Нет	Есть

Апоптоз можно рассматривать как контролируемый на организменном уровне саморегулируемый клеточный суицид, главным проявлением которого является деградация ДНК. Такая деградация представляет собой активный процесс, зависящий от температуры, источников энергии, синтеза РНК и белка de novo. Различные этапы деградации ДНК катализируются разными формами эндонуклеаз, отличающихся субстратной специфичностью и условиями проявления активности. В ходе деполимеризации ДНК происходит образование все более мелких фрагментов. Сначала образуются фрагменты, включающие 700, 200-250, 50-70 тысяч пар оснований, затем фрагменты, содержащие 30-50 тысяч пар оснований. Формирование последних связывают с расщеплением специфического белка – топоизомеразы II. Этот белок выполняет структурную и ферментативные функции и участвует в построении структур ДНК высшего порядка – суперспирализированных петель. Они (петли) содержат по 50 тысяч пар оснований. Шесть таких петель, объединенных в единую дисковидную розетку, образуют еще более сложную структуру, имеющую 300 тысяч пар оснований. На этой стадии происходит конденсация хроматина и инвагинация ядерной мембраны, после чего процесс становится необратимым.

Затем наступает очередной этап деградации, который служит наиболее принятым опознавательным признаком апоптоза: межнуклеосомная дезинтеграция ДНК, т.е. разрывы нитей ДНК, находящиеся между нуклеосомами. При этом образуются фрагменты, кратные по величине 180-190 тысяч пар оснований, что соответствует протяженности нити ДНК в пределах одной нуклеосомы. Этот тип деградации обычно завершается в течение суток [57]. Считается, что межнуклеосомный разрыв нитей ДНК связан с протеолитическим расщеплением еще одного ядерного белка - гистона Н1, который служит основным компонентом в компактной укладке суперспирали ДНК, обеспечивая сборку и конденсацию нуклеосом в структурах высшего порядка. Наряду с ролью универсального репрессора генной активности, именно гистон Н1 защищает ДНК от действия эндонуклеаз на межнуклеосомальном уровне [5]. При нарушении его защитной функции и происходит межнуклеосомальная деградация ДНК в 180 тысяч пар оснований и кратные им. Считается [38], что этот тип деградации обеспечивается активацией Са²⁺/Mg²⁺-зависимой ДНК-азой – САD (каспазактивируемая ДНК-аза).

Активация эндонуклеазы и фрагментация ДНК сами по себе уже неизбежно обеспечивают гибель клетки. Однако, согласно современным представлениям, фрагментация ДНК только одна из стадий этого процесса [39]. Следующий этап развития клеточного коллапса обусловлен вовлечением в процесс ядерного фермента – ПАРП (поли-АДФ-рибозил-полимеразы), который активируется в присутствии поврежденной ДНК. Субстратом для этого фермента служит окисленная форма НАД, расщепляемая ПАРП на никотинамид и АДФ-рибозильный фрагмент, содержащий по 2 остатка рибозы и фосфата на 1 остаток аденина (рис. 4.2.1.А).

Из таких фрагментов, путем их последовательного соединения друг с другом происходит синтез поли-АДФ-рибозы (рис. 1 Б). Данный процесс важен для модификации многих белков, которая осуществляется путем последующего конъюгирования полимеров АДФ-рибозы с белковыми молекулами. К одной молекуле белка за счет полимеризации может присоединиться несколько десятков – до 80 и более остатков АДФ-рибозы, в результате чего меняется структурная организация белков и их активность.

Происходящее при повреждении ДНК активация ПАРП и рибозилирование белков в принципе представляют собой защитную реакцию, укладывающуюся в контекст общепринятого положения о роли ПАРП в стабилизации генома. Считается, что ПАРП в комплексе с ДНК-лигазой препятствуют расхождению концов разорванных нитей цепей ДНК и способствуют «склеиванию» разрывов. Что касается поли-АДФ-рибозилирования белков, то его рассматривают как механизм, препятствующий ранней транскрипции разрывов ДНК и, таким образом, ограничивающий хромосомные абберации [39]. Вместе с тем, в рамках рассматриваемого вопроса существенное значение имеет то обстоятельство, что при множественности повреждения генома, как это происходит при фрагментации ДНК под влиянием эндонуклеазы, данный древнейший (имеющий место у про- и эукариотов) эволюционно сложившийся механизм стабилизации генома приобретает разрушительный характер [39]. Количество синтезируемой на базе НАД поли-АДФ-рибозы может достигать значительных величин (до 10% массы клеточной ДНК) и сопровождается резким истощением пула НАД, что приводит к нарушению ресинтеза макроэргов. Имеющиеся в клетках запасы макроэргов быстро утилизируются в энергозависимых процессах (в том числе связанных и с компенсаторным синтезом НАД) и начинается необратимая в условиях энергодефицита деградация пуринов до конечного продукта – мочевой кислоты (рис. 4.2.2.). Как видно из рисунка, последние два превращения – окисление гипоксантина и до ксантина и ксантина до мочевой кислоты катализируются ферментом – ксантиноксидазой. В обычных условиях фермент почти полностью ингибирован, но активируется при накоплении монофосфатов: (АМФ и ГМФ). Эти ферментативные превращения продуктов пуринового обмена сопровождаются образованием супероксидного анион-радикала.

Стехиометрия ксантиноксидазных реакций такова, что на 1 молекулу мочевой кислоты генерируются 4 молекулы О₂^-. Данная активная форма кислорода и производные от нее АФК модифицируют структуру большинства макромолекул, а следовательно, изменяя их функциональную активность в еще большей степени дезорганизуют внутриклеточные процессы и приближают наступление финала. Еще одно негативное последствие АДФ-рибозилирования белков, в частности, гистона Н1 может быть связано с изменением структуры хроматина в виде деконденсации полинуклеосом и ослабления контактов гистон-ДНК. В результате возрастает доступность ДНК для нуклеаз. Наконец, не исключено и непосредственное участие ПАРП в активации эндонуклеаз, хотя это положение не всегда находит подтверждение.

Общая схема участия ПАРП деградации хроматина и гибели клеток при апоптозе представлена на рисунке 4.2.3.

Таким образом, на процесс апоптоза могут влиять, по крайней мере, несколько последствий поли-АДФ-рибозилирования [31]: непосредственное изменение активности эндонуклеазы, осуществляющей деградацию ДНК; нарушение функциональной активности белков в результате модификации их структуры; изменение структуры хроматина за счет поли-АДФ-рибозилирования гистона Н1, облегчающее доступ эндонуклеазы к ДНК цепям; истощение пула НАД-субстрата, приводящее к резкому энергодефициту и генерация АФК.

Апоптотическая деградация ДНК является терминальной стадией апоптоза [4]. Вместе с тем этой стадии предшествует ряд более ранних этапов, связанных с индукцией апоптоза, проведением апоптотического сигнала и активацией механизмов, обеспечивающих деградацию не только хроматина, но и демонтаж других клеточных структур. Центральная роль в ряду этих механизмов принадлежит специфическим протеазам – каспазам.

Каспазы – цистеиновые протеиназы (присутствие цистеинового остатка в активном центре), расщепляющие белки в местах расположения аспарагиновых оснований. Сегодня идентифицировано 14 видов каспаз, которые по функциональным особенностям делят на 3 группы [14]:

- активаторы цитокинов (1, 4, 5, 11, 13);

- индукторы активации эффекторных каспаз (2, 8, 9, 10, 12);

- эффекторные каспазы (3, 6, 7).

Каспазы синтезируются в виде неактивных предшественников (зимогенов). Активация индукторных каспаз происходит путем саморасщепления предшественника в местах расположения аспарагиновых оснований с образованием двух субъединиц (р20 и р10) активного фермента, димеризация которых формирует их активный центр. Т.о. полный фермент представляет собой тетрамер из двух видов субъединиц (рис. 4.3.1.).

Важно, что каскад ауторасщепления происходит только после того, как молекулы предшественника входят в состав многокомпонентного белкового комплекса, который создает необходимые стерические условия для самоактивации.

Активация эффекторных каспаз осуществляется также путем расщепления на аналогичные субъединицы, но при участии индукторных каспаз.

Эффекторные каспазы осуществляют апоптотический демонтаж клетки. Мишенями эффекторных каспаз служат:

- ингибиторы апоптоза. В частности, каспазактивируемая ДНК-аза (САD), вызывающая фрагментацию ДНК находится в связи с ингибитором (I), т.е. в форме ICAD. Каспазы 3, 7 разрушают ингибитор и тем самым активируют САD (рис. 4.3.2.).

- структурные белки клетки. Так, каспаза 6 расщепляет ядерный ламин – белок жестко связанный с ядерной мембраной и организующий структуру хроматина. Разрушение ламина приводит к конденсации хроматина и его прикреплению к внутренней поверхности мембраны. Разрушаются белки цитоскелета, в т.ч. фодрин, гельолин и актин (рис. 4.3.3.).

Протеолиз этих белков обусловливает перестройку цитоскелета, что наряду со сшивками белковых молекул под влиянием трансглутаминазы приводит к блеббингу - образованию характерных выпячиваний плазматической мембраны. Этот процесс сопровождается также нарушением ассиметрии распределения фосфолипидов между внутренним и наружным слоями мембраны, свойственным нормальным клеткам. В частности, в наружном монослое отсутствуют аминофосфолипиды: фосфатидилсерин и фосфатидилэтаноламин. Такая ассиметрия поддерживается особым АТФ-зависимым белком, переносящим эти аминофосфолипиды с наружного во внутренний монослой мембраны. Нарушение ассиметрии мембраны и появление на ее наружной поверхности фосфатидилсерина способствует распознаванию таких клеток (апоптозных телец) фагоцитами с помощью специальных рецепторов MFG-E8 (milk fat globule-EGF-factor-8), взаимодействующих с фосфатидилсерином. Следствием подобного взаимодействия является фагоцитоз апоптотических телец, осуществляемый клетками моноцитарно-макрофагальной системы. Считается, что нейтрофилы в фагоцитозе апоптозных телец не участвуют [31].

- белки, вовлеченные в процессы репарации ДНК (ПАРП), отвечающие за структурную организацию хроматина (топоизомеразы, гистоны), за сплайсинг мРНК (UI-70K), за репликацию ДНК (репликативный фактор С). Каспазы отщепляют регуляторные и каталитические субъединицы этих белков, в результате чего они утрачивают активность (рис. 4.3.4.).

Таким образом, «участие эффекторных каспаз в апоптозе напоминает хорошо спланированную военную акцию, направленную на уничтожение: разрыв связи с окружающими клетками; реорганизацию цитоскелета; разрыв ядерной мембраны и разрушение ДНК; выброс сигналов, маркирующих клетку для апоптоза; расчленение клетки на апоптотические тельца» [14].

Каспазы, являясь основными эффекторами апоптоза, не до конца монополизируют эту клеточную активность. В ряде клеточных систем апоптоз может протекать и при инактивации каспаз за счет активности других эффекторов, таких как активируемые кальцием протеазы (кальпаины), сериновые и лизосомальные протеазы, эндонуклеазы. Однако значение этих эффекторов в реализации апоптоза невелико и чаще всего носит дополнительный характер.

Существуют 2 главных механизма, индуцирующих клеточную гибель с участием каспаз (рис. 4.3.5.).

Важно, что эффекторная фаза этих двух путей перекрывается или даже совпадает. Но и начальная стадия этих путей также разобщена не полностью. Рассмотрим эти пути.

А. Митохондрии как источник медиаторов апоптотического сигнала

Митохондрии – гранулярные или нитевидные органоиды, присутствующие в цитоплазме, матрикс которых окружен двухслойной мембраной. Митохондрии содержат геном, способный кодировать ограниченное число РНК и белков, необходимых для их функции, но большинство компонентов митохондрии кодируются в ядре, а затем импортируются в них. Митохондрии – генераторы клеточной энергии. В то же время они – и ключевая фигура апоптоза. Это связано с тем, что митохондрии служат источником компонентов, необходимых для продвижения апоптотического сигнала, включая цитохром С, апоптозиндуцирующий фактор (АIF), АТФ, Са²⁺, вторичный митохондриальный активатор каспаз (Smac/DiABLO), эндонуклеазу G. Высвобождение этих белков происходит вследствие открытия высокопроницаемого канала – т.н. митохондриальной поры (диаметром до 2 нм), располагающейся в местах сближения наружной и внутренней мембран. Данные поры функционируют как сенсоры многих физиологических параметров и таким образом передают информацию об основных метаболических процессах, происходящих в клетках. Они служат каналами для Н⁺, Са²⁺-ионов, вольтажа, активных форм кислорода (АФК), но не пропускают некоторые анионы и непроходимы для более крупных молекул.

В состав этих пор входят [16]: транслокатор адениновых нуклеотидов – ANT (adenin-nucleotid-translokator), потенциалзависимый анионный канал (порин) и бензодиазепиновый рецептор с внешней стороны мембраны. С митохондриальной порой ассоциированы и другие белки: члены семейства Bcl 2, циклофилин D и ферменты энергетического метаболизма: гексокиназа и креатинкиназа. При связывании ионов Са²⁺ этот комплекс образует увеличенную мембранную пору (мегаканал) диаметром 2,6-2,9 нм, способную пропускать низкомолекулярные вещества с Мr ≤ 1500, что приводит к быстрому освобождению кальция, снижению трансмембранного потенциала митохондрий, их высокоамплитудному набуханию и выходу проапоптотических сигнальных молекул. Открытие поры стимулируется рядом факторов, в том числе неорганическим фосфатом, прооксидантами, SH-реагентами и истощением митохондриального пула АТФ. Напротив, ионы Mg²⁺, адениновые нуклеотиды, антиоксиданты, циклоспорин А способствуют закрытию поры [16].

В процессе высвобождения проапоптотических белков митохондрии разрушаются.

Цитохром С – белок с молекулярной массой 15 кД кодируется ядерным геномом, синтезируется как апоцитохром С, импортируется в митохондрии, где будучи положительно заряженным, прикрепляется к отрицательно заряженной внутренней поверхности мембраны [45]. В обычных условиях он удерживается в митохондриях специфическим митохондриальным отрицательно заряженным фосфолипидом внутренней мембраны – кардиолипином. Эта связь обусловлена с одной стороны электростатическим взаимодействием между положительно заряженными остатками лизина в цитохроме С и отрицательно заряженными фосфатными группами в кардиолипине; с другой – гидрофобным взаимодействием между углеродной цепью кардиолипина и гидрофобными участками молекулы цитохрома С, обусловливающими ее частичное погружение в мембрану. В связи с этим очевидно, что для выхода цитохрома С одного лишь нарушения целостности мембраны (открытие мегаканалов) недостаточно. Считается, что электростатически связанный цитохром С мобилизуется при изменении ионной силы, плотности поверхностного заряда или рН, а гидрофобно связанный – при окислительной модификации митохондриальных липидов [16].

Роль цитохрома С в развитии апоптоза заключается в том, что он необходим для образования апоптосомы, где происходит активация индукторной каспазы 9, которая, в свою очередь, активирует основную киллерную каспазу 3.

Апоптосома представляет собой белковый комплекс, который необходим для самоактивации индукторных каспаз. Наряду с цитохромом С апоптосома включает в себя апоптотический протеазоактивирующий фактор APAF-1 (apaptotic protease activating factor-1), АТФ и каспазу 9.

APAF является цитозольным белком, который до соединения с цитохромом С существует в неактивном состоянии. В присутствии цитохрома С APAF подвергается олигомеризации и играет роль «арматуры», на которой происходит протеолитический процессинг прокаспазы 9 (рис. 4.4.1.).

АТФ также необходим для образования апоптосомы. При отсутствии достаточного количества молекул АТФ апоптосома не образуется, и гибель клеток идет по некротическому пути.

Таким образом, после сборки всех компонентов апоптосомы в ней происходит активация прокаспазы 9, которая в свою очередь активирует терминальные (эффекторные) каспазы 3 и 7. Последние обеспечивают цепь протеолитических событий, приводящих к апоптотическому демонтажу клетки, и ее расчленению на «апоптотические тельца».

Следует отметить, что каспаза 9 может активироваться и без участия цитохрома С под влиянием каспазы 12.

Митохондриальный механизм апоптоза не исчерпывается образованием апоптосомы. В его развитии принимает также участие и другие митохондриальные факторы. К их числу относятся митохондриальный белок со свойствами оксидоредуктазы (флавопротеин) – апоптозиндуцирующий фактор – АIF. Синтез АIF кодируется ядерным геномом, но превращение его в зрелую форму (белок с молекулярной массой 75 кД) происходит в митохондриях.

Выходя из митохондрий, AIF накапливается в ядре клетки, где вызывает фрагментацию ДНК. AIF выделяется из митохондрий до цитохрома С, не требует цитозольной активации и, возможно, даже способствует выходу цитохрома С. В ядре AIF активирует эндонуклеазу, разрывающую ядерную ДНК на крупные фрагменты длиной 50 тыс. пар оснований и более. Апоптоз, вызванный AIF протекает без участия каспаз. Оксидорудектазная активность этого белка не имеет значения в реализации его проапоптотических свойств. Таким образом, AIF является самостоятельным киллерным фактором, дублирующим действие цитохрома С и каспаз при их блокировании. Белок теплового шока 70 (HSP 70) является эндогенным ингибитором AIF и блокирует апоптотическое действие последнего как в условиях in vivo, так и in vitro [35].

Smac/DIABLO (second mitochondria – derived activator of caspases / direct IAP-binding protein with low p1) – представляет собой 25 кДа митохондриальный полипептид, активирующий каспазы 3, 7 и 9. Эффекты этого полипептида обусловлены его блокирующим действием на белки – ингибиторы апоптоза – IAP (inhibitors of apoptosis proteins). Кодируемые Х-хромосомой IAP (XIAP) и клеточные ингибиторы апоптозных белков (с-IAP) подавляют активность каспаз 3, 7 и 9, экранируя их активные сайты и вызывая протеолитическую деградацию при помощи своих концевых BIR (baculoviruses inhibitor of apoptosis repeat domains) и RING (really interesting new gene) доменов [45]. К молекулам IAP относится особый белок Survin, обнаруживаемый в клетках большинства злокачественных опухолей, что делает их устойчивыми к апоптозу. С этим же белком связывают резистентность опухолевых клеток к химиопрепаратам.

Smac/DIABLO, связываясь с IAPs нарушает их взаимодействие с каспазами, ускоряя таким образом, активацию последних.

Эндонуклеаза G содержится в митохондриях. Доставка этой эндонуклеазы в ядро в клетках, дефектных по CAD (каспазактивируемой ДНК-азы) обечпечивает межнуклеосомальное расщепление ДНК.

Таким образом, до тех пор, пока проапоптотические факторы находятся внутри митохондрий, их действие на клетку не реализуется. Оно становится возможным лишь в условиях выхода этих факторов из митохондрий в цитозоль. На изолированных митохондриях печени показано, что выход цитохрома С может быть Са²⁺-зависимым и Са²⁺-независимым [16]. В первом случае открытие митохондриальной поры, приводящее к высвобождению цитохрома С, обусловлено повышением внутримитохондриальной концентрации Са²⁺. Независимый от Са²⁺ выход цитохрома С контролируется белками семейства Bcl 2 (B-cell leukaemia-2).