6. При получении генноинженерного инсулина:

Какие микроорганизмы используются в качестве продуцентов?

Почему ферментационные среды должны содержать лактозу и галактозу?

Ответ

Инсулин (от лат. insula - остров) - гормон пептидной природы, образуется в клетках островков Лангерганса поджелудочной железы. Инсулин оказывает влияние на обменные процессы практически во всех тканях. Основное действие инсулина заключается в снижении концентрации глюкозы в крови.

Молекула инсулина образована двумя полипептидными цепями, содержащими 51 аминокислотный остаток: A-цепь состоит из 21 аминокислотного остатка, B-цепь образована 30 аминокислотными остатками. Полипептидные цепи соединяются двумя дисульфидными мостиками через остатки цистеина, третья дисульфидная связь расположена в A-цепи.

Рис. 1. Молекула проинсулина и ее активация («вырезание» С-пептида).

Биосинтез инсулина - сложный процесс, включающий несколько этапов. В процессе созревания из молекулы проинсулина с помощью специфических эндопептидаз вырезается C-пептид - фрагмент из 31 аминокислоты, соединяющий B-цепь и A-цепь.

В настоящее время гормон инсулин получается в основном биотехнологическим методом. В качестве микроорганизма используемого для синтеза инсулина используют бактерии E. Coli, в геном которых включена последовательность ДНК инсулина человека. Гены А- и В- цепей инсулина синтезируются раздельно. На 5- конце каждого из них располагается кодон метионина (на N-конце инсулина), а на 3- конце – терминирующие последовательности. Каждый из генов встраивается в ген -галактозидазы плазмид, а их в свою очередь вводят в клетки E. Coli. Поскольку бактерии растят на среде с галактозой, а не с глюкозой, в них индуцируется синтез -галактозидазы, а вместе с ней – А- и В- цепей инсулина, присоединенных через остаток метионина.

После лизиса бактерий и обработки бромцианом (гидролиз по остатку метионина) цепи инсулина отделяют от -галактозидазы. Затем проводят очистку цепей и их объединение, в результате чего образуется нативный двухцепочечный инсулин.

Возможно встраивание в геном E.coli ДНК целого проинсулина, получение его в виде одного белка. Далее с использованием протеазы трипсина «вырезают» С-пептид, и образуется активный инсулин.

Питательные среды, используемые для выращивания продуцента инсулина E.coli, должны содержать галактозу потому что она способствует более интенсивному синтезу -галактозидазы, а в месте с ней А- и В- цепей инсулина. Лактоза добавляется в среды как дополнительный источник энергии для бактерии. Она постепенно усваивается микроорганизмом, не вызывая катаболитную репрессию, как глюкоза. Так высвобождающаяся при гидролизе лактозы глюкоза репрессирует -галактозидазу, в результате чего гидролиз лактозы (и появление в среде глюкозы) замедляется. В результате количество инсулина (вторичного метаболита) увеличивается.