Принцип метода гель электрофореза

Электрофорез в агарозном геле.

Принцип метода электрофореза.

Электрофорез – метод разделения макромолекул, различающихся по таким параметрам, как размеры (или молекулярная масса), пр о- странственная конфигурация, вторичная структура и элек трический заряд.

Принцип метода:

Физический принцип метода заключается в следующем. Наход я- щиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым су м- марным электрическим зарядом, величина и знак которого зависит от рН среды. Если через этот раствор, зак люченный в канал из изолирующего материала начать пропускать электрический ток, то вдоль канала установится определенный градиент напряжения, т.е. сформируется электрическое поле. Его напряженность измеряется разностью поте н- циалов по концам канала, отнесен ной к его длине (В/с). Под действием поля макромолекулы в соответствии со своим суммарным зарядом м и- грируют в направлении катода или анода, причем их трение об окр у- жающую среду ограничивает скорость миграции. В зависимости от в е- личины заряда и размеров мол екулы приобретают различные скорости. Постепенно исходный препарат, состоящий из различных молекул, ра з- деляется на зоны одинаковых молекул, мигрирующих с одинаковой скоростью. В современных приборах рабочий канал заполняют гелем, наличие сетки которого вн осит важную дополнительную деталь в эле к- трофоретическую миграцию молекул. Фракционируемые молекулы сталкиваются с нитями полимера, образующую сетку геля, что увел и- чивает сетку геля и снижает скорость движения молекул. Препятствия для миграции становятся о собенно серьезными, если средний размер пространственных ячеек геля оказывается соизмерим с размерами ма к- ромолекул. В этом случае решающее влияние на электрофоретическую подвижность различных макромолекул и степень разделения оказывает соотношение их линей ных размеров. Возможна даже такая ситуация, когда особенно крупные молекулы белков или нуклеиновых кислот в о- обще не могут «протиснуться» через поры геля и их миграция прекр а- титься.

В настоящее время используют ПААГ и агарозный гель. В а- рьируя концентрацию полимера, можно получать гели с очень шир оким диапазоном размеров пор. Кроме того, можно изменять электрич еские заряды макромолекул путем вариации рН буфера, а их конфигур ацию путем введения в буфер денатурирующих агентов или детергентов. Все это придает методу электрофореза исключительную гибкость.

В ходе электрофореза зоны макромолекул остаются невид и- мыми. Для наблюдения за процессом в исходный препарат добавляют краситель, молекулы которого несут электрический заряд того же зн а-

1

ка, что и фракционируемые молекулы, но не взаимодействуют с ними. Краситель тоже передвигается в электрическом поле, но уже в виде окрашенной зоны. Его подбирают таким образом, чтобы скорость м и-

грации наиболее подвижных макромолекул была несколько ниже, чем у молекул красителя. Когда окрашенная зона доходит до конца трубки, электрофорез прекращают.

Разделившиеся зоны биополимеров во избежание их дифф у- зии немедленно фиксируют. Для этого гель извлекают из стеклянной формы и вымачивают в смеси, кислоты выпадают в осадок в том мес те, где закончилась их миграция в ходе электрофореза. После фиксации (или одновременно с ней) проводят окрашивание зон путем вымачив а- ния геля в растворе красителя, прочно связывающегося с белком или нуклеиновой кислотой. Излишек красителя удаляют.

Вместо цилиндрических часто используют гели в виде тонких пластин, заполимеризованные между двумя плоскими стеклами. Такие пластины имеют важное преимущество: на них можно одновременно фракционировать несколько препаратов. Обычно их вносят с одного края геля на равных расстояниях друг от друга. Каждый препарат ра з- деляется в электрическом поле независимо от своих соседей, образуя свой набор зон. Кроме того, поскольку гель заливают в форму для п о- лимеризации жидким, то его концентрация, состав буфера и содерж а- ние добавок строго одинаковы по всему сечению геля. Следовательно, плотность тока и напряжение электрического поля также одинаковы. Это обеспечивает строго идентичные условия фракционирования ра з- ных препаратов и дает возможность достоверного сопоставления их с о- става путем сравнения положения полос в параллельных треках.

Особенности агарозного геля.

Агароза – это особо чистая фракция природного линейного пол и- сахарида агара, который получают из морских красных водорослей

(Gracilaria, Gelidium, Ahnfeltia).

Агароза состоит из строго чередующихся остатков 3-О- замещенной-β-D-галактопиранозы и 4-О-замещенной 3-6-ангидро-α-L- галактопиранозы. Молекулярная масса ее составляет 10 4 -105 . Гелеобразование идет путем связывания в пространственную сетку пучков нитей за счет водородных связей между ними. Некоторые виды агарозы обр а- зуют прочные гели уже при концентрации 0,3%.

При температурах 84 -96o (а у специальных типов – уже при 70 o ) раствор агарозы переходит в прозрачную жидкость – «плавится». Вязкость расплавленного 1%-ного раствора агарозы составляет 10 -15 с П, что примерно соответствует вязкости 50% -ного раствора сахарозы при комнатной температуре. Растворы агарозы характеризуются ярко выр а- женным гистерезисом: они затвердевают, образуя гель, при значител ь- но более низких температурах (36 -42 o ). У легкоплавких типов агарозы

2

эта температура снижается до 30 o . Такая особенность облегчает ман и- пуляции с расплавленной агарозой - можно не опасаться преждевременного ее застывания в гель. Более того, расплавленную агарозу пре д- варительно охлаждают до 50 -55 o и уже при этой температуре заливают

вформы; это удобно и не связано с возникновением значительных те п- ловых деформаций.

Гели агарозы не вполне прозрачны, что обусловлено «кристалл и- зацией» геля.

Затвердевший гель представляет собой н е вполне равновесную систему: со временем он несколько уплотняется, выдавливая из себя жи д- кость. Температура плавления и гелеобразования зависят от с одержания в агарозе метоксильных групп, которое может достигать 3 -4%. Наличие этих групп затрудняет гелеоб разование.

Вагарозе неизбежно содержатся и эфиры серной кислоты. Чем меньше в агарозе заряженных сульфогрупп, тем слабее силы электр о- статического отталкивания между молекулами полимера и выше их способность к связыванию водородными связями. Их присутствие существенно влияет не только на температуры плавления и застывания гелей, но и на сам процесс электрофореза. В частности, именно эфиры серной кислоты обусловливают сильно выраженное при электрофорезе

вгелях агарозы явление эндосмоса, суть которого в след ующем: отрицательно заряженные остатки серной кислоты неподвижно связаны с полимерными нитями агарозы. Соответствующие им положительные ионы, находясь в водной фазе под действием электрического поля м и- грируют в направлении катода. Их место занимают катионы, которые увлекают за собой всю массу жидкости, находящейся внутри геля, и вместе с ней – растворенные в водной фазе геля макромолекулы. Эле к- трофорезом в агарозном геле чаще всего разделяют отрицательно зар я- женные макромолекулы, а эндосмос направлен в про тивоположную сторону и ухудшает разделение. Поэтому агарозу подвергают спец и- альной очистке, и содержание иона сульфата в продажных препаратах не превышает 0,5%.

Рис. 1. Влияние эндосмоса в агарозном геле на характер фракционирования двунитевых ДНК одина кового разме-

ра [Johnson et al., 1980]

3

1 — сверхскрученная ДНК; 2 — линейная; 3 — кольцевая; степень эндосмоса увеличивается слева направо

Типы агарозы, отличающиеся слабо выраженным эндосмосом, с о- держат менее 0,3% сульфата. В случае необходимости мо жно провести дополнительную очистку агарозы от сульфата обработкой 1М NаОН в 0,05%-ном боргидриде натрия и переосаждением 50% -ным этанолом. Наличие заряженных сульфогрупп иногда обусловливает еще и не специфическую сорбцию белков на агарозе, в результате чег о полосы расплываются с образованием «хвостов». Степень эндосмоса колич е- ственно оценивают с помощью коэффициента относительной миграции

(-mr ) – представляющего собой отношение скоростей миграции незаряженного полимера (за счет только эндосмоса) и сходного с ним по структуре полианиона при электрофорезе в агарозе данного типа.

Некоторые типы агарозы по номенклатуре фирмы « Miles»: тип LE – малая степень эндосмоса -mr =0,1-0,15;

тип HE – сильно выраженный эндосмос -mr =0,23-0,26.

Агароза с повышенными темпера турами плавления и гелеобразования (тип HGT) имеет -mr <0,1, именно она чаще всего используется для обычного электрофореза. Специальная технологическая обработка (введение оксиэтильных групп) позволяет получать агарозу с малой степенью эндосмоса и пониженн ыми температурами плавления и затвердевания, например тип LGT, 1%-ный раствор такой агарозы остается жидким при физиологической температуре (37º); кроме того плавл е- ние геля можно осуществить при температуре более низкой, чем темп е- ратура денатурации ДНК. Дл я иммуноэлектрофореза, при котором и м- муноглобулины мигрируют к катоду и эндосмос способствует, а не препятствует их разделению, была разработана специальная агароза типа HEEO с сильно выраженным эндосмосом ( -mr >0,3) , но не за счет увеличения сульфатов, б лагодаря чему неспецифической сорбции белков на агарозе этого типа почти не происходит.

Агароза для электрофореза выпускается обычно в виде лиофилизированного порошка. Для приготовления геля выбранной концентр а- ции навеску порошка растворяют в соответствую щем буфере и нагре-

вают до 90-95 o . Перед заливкой в форму раствор агарозы охлаждают до 50 o .

Выбор концентрации агарозы, т.е. пористости ее геля, диктуется размерами фракционируемых макромолекул. Средний размер пор 2% - ного геля агарозы приблизительно соот ветствует диаметру сферически упакованной молекулы биополимера с массой 50 млн. дальтон. Гели с более высоким содержанием агарозы используют для гель -фильтрации. При электрофорезе поры геля должны быть легко проницаемы для м о- лекул биополимеров, чтобы лишь тормозить их миграцию в электрич е- ском поле за счет трения, поэтому для электрофореза применяют аг а-

4

розные гели с концентрацией 0,4 -2%. Ниже представлены примерные концентрации гелей агарозы (в %) для некоторых распространенных объектов фракционирования:

Разновидности электрофореза в агарозном геле.

Современные варианты электрофореза используют пластинки или колонки с агарозным гелем.

В зависимости от цели исследований эоектрофорез в агарозном геле может быть аналитическим и/или препаративным.

Аналитический электрофорез в агарозном геле имеет целью электрофоретическое разделение макромолекул с последующей визуализ а- цией и анализом полученных результатов.

Агарозный электрофорез применяют в препаративных целях. Для извлечения из геля разделенных компо нентов используют несколько способов: агарозный гель подвергают элюции буферными растворами, центрифугированию, замораживанию и оттаиванию.и др.

Аппаратура

Вертикально расположенные трубки

Вертикальное расположение гелей и меет то преимущество, что препарат, наносимый на гель сверху, при любом его объеме равномерно покрывает всю рабочую поверхность геля. Затруднение при вертикал ь-

5

ном расположении могут возникать при недостаточной сцепле нности геля со стеклом, он будет сползат ь вниз.

Все приборы для с вертикальным расположением гелей ко н- структивно сложнее, чем аппараты с горизонтальным расположением, т.к. верхний электродный резервуар должен быть поднят над гелем.

Необходимо уплотнение в местах сочленения его с трубками или пл а- стинами.

Трубки (12-18штук) с уже заполимеризованным в них гелем вставляют снизу в резиновые прокладки так, чтобы их верхние концы выступали над дном резервуара. Если используют не все трубки, то на их место ставят заглушки. Собранный вместе с трубками в ерхний электродный резервуар устанавливают на нижний так, чтобы концы трубок оказались на некотором расстоянии от дна последнего и заполняют нижний резервуар электродным буфером до такого уровня, что трубки оказываются почти полностью погруженными в буфер. Это делается для улучшения теплоотвода в процессе электрофореза. С этой же целью нижний буфер перемешивают магнитной мешалкой или вводят допо л-

нительную охлаждающую систему. Оба резервуара цилиндрической или прямоугольной формы изготавливают из плексигласа , что позволяет следить за продвижением фронта красителя. В резервуарах должны быть закреплены электроды из платиновой проволоки. Нижний эле к- трод при этом должен располагаться так, чтобы поднимающиеся от н е- го пузырьки газа не попадали на нижние торцы трубо к, что создавало бы помехи протекания через них тока. Объемы электродных резерву а- ров достаточно велики, чтобы рН находящегося в них буфера не изм е- нялся под влиянием продуктов электролиза.

Для заливки и полимеризации геля нижние торцы трубок з а- клеивают парафильмом и устанавливают строго вертикально в штатив. Заливают гель. Собрав прибор, заливают буфер в верхний электродный резервуар. При полимеризации геля часть трубки с верхнего ее конца оставляют свободной, и туда при заливке попадает буфер. Затем под него, на поверхность геля, пипеткой наслаивают препарат, в который добавляют предварительно 5 -10% сахарозы. При любом варианте эле к- трофореза надо быть уверенным в том, что исходный препарат своб о- ден от взвешенных частиц (пыли или осадков), которые будут соб и- раться на торце геля и однородность тока по его сечению, что повлечет за собой деформацию разделяющихся зон. В этом случае препарат сл е- дует отфильтровать или очистить центрифугированием.

По окончанию электрофореза гель из трубки извлекают. В большинстве случаев это легко сделать с помощью длинной и зату п- ленной иглы шприца, которую вводят с одного из концов трубки, кр у- говыми движениями отслаивая гель от ее стенок. Если необходимо т а- кую операцию проводят и с другого конца. Через иглу при этом пост у- пает вода из закрепленного выше резервуара. Если гель отслаивается с трудом, в воду можно добавить 0,5 -1% раствор детергента. Во избеж а-

6

ния поломки следует дать гелю возможность выскользнуть из трубки в сосуд с водой, над которым проделывают эти манипуляции. Иногда д ля удаления геля из очень длинных трубок по его периферии с концов впрыскивают глицерин, а сам гель выталкивают водой из присоединя е- мого к трубке шприца. Если гель высокой концентрации вынуть не уд а- ется, его приходится замораживать, а трубку разбивать моло тком. Иногда можно решить проблему путем вымачивания трубки с гелем в мет а- ноле: гель постепенно съеживается и отстает от стенки.

Основным недостатком электрофореза в трубках является з а- трудненный отвод тепла даже при диаметре 5мм. На оси геля темпер а- тура оказывается выше, чем у его прилегающей к стеклу поверхности.

Это приводит к изгибу зон и соответственно окрашенных полос, п о- скольку электрофоретическая подвижность зависит от температуры. В условиях хорошего теплоотвода можно вести микроэлектрофорез в к а- пиллярах диаметром 0,7 -1,5мм.

Вертикально расположенные пластины

Для электрофореза белков обычно используют пластины ш и- риной 8-14 см и длиной (в направлении электрофореза) 8 -28 см.

Полимеризацию акриламида или застывание агарозы, а затем и электрофорез ведут в форме, образованной двумя пластинами зе р- кального стекла толщиной 5 -6мм. Расстояние между пластинами зад а- ется толщиной прокладок из тефлона или плексигласа («спейсеров») и определяет толщину геля. Прокладки шириной 10 -15мм устанавливают вдоль боковых краев стекол. Эти же прокладки можно использовать и для уплотнения формы во время нахождения в ней еще не затвердевш е- го геля. Для этого устанавливают еще одну прокладку точно такой же толщины по нижнему краю стекол и плотно прижимают ее к фрезер о- ванным торцам боковых прокладок.

При заливке агарозы уплотнение формы можно осуществить проще - заклеить торцы стекол липкой лентой. Нижнюю прокладку при этом можно не устанавливать. Уплотнение не будет совершенным, но агароза в контакте с прокладками и лент ой быстро застынет и заметного ее вытекания не будет. Для надежности можно сначала залить н е- большой слой агарозы и дать ей застыть в нижней части формы, а п о- том залить остальной ее объем.

Собранную и уплотненную форму устанавливают вертикал ь- но и заливают в нее раствор мономеров ПААГ или расплавленную аг а- розу.

В аналитических опытах на каждой пластине обычно ведут электрофорез нескольких препаратов, состав которых можно затем с о- поставить при идентичных условиях разделения. Сопоставляемые пр е- параты фракционируют в параллельных друг другу «треках». В ходе полимеризации на верхнем крае геля формируют ряд одинаковых углублений прямоугольной формы - «карманов», в которые затем вн о-

сят исследуемые препараты. Для этого в еще незаполимеризовавшийся

7

гель или горячую агарозу вставляют гребенку из тефлона или плекс и- гласа. Прямоугольные зубцы гребенки и формируют карманы.

Гель или агарозу заливают между пластинами с таким расч е- том, что при опускании гребенки до упора жидкий гель заполнил пр о- межутки между ее зубцами. Гре бенку начинают вставлять с некоторым перекосом, чтобы под ее зубцами не задерживались пузырьки воздуха. Когда гель готов, вынимают нижнюю прокладку или снимают липкую ленту и осторожно вытаскивают гребенку. При работе с концентрир о- ванным ПААГ гель может прилипать к зубцам гребенки и нижние плоскости карманов могут оказаться неровными. Это ухудшает условия формирования исходных полос в геле. В таком случае имеет смысл вв е- сти еще один слой геля пониженной концентрации, и гребенку устана в- ливают в него.

Для проведения электрофореза чаще всего используются приборы конструкции, предложенной Стадиером. Верхний и нижний резервуары прямоугольной формы соединены вертикальной стенкой, в которой имеется вырез, ведущий в полость верхнего резе рвуара. Такой

же вырез имеет и одна из двух стеклянных пластин, меду которыми п о- лимеризуется гель. Пластины прижимаются пружинными зажимами к вертикальной стенке так, чтобы оба выреза совпадали. Буфер в верхний резервуар заливают до такого уровня, чтобы он через в ырез покрывал верхний торец геля. При этом вторая, не вырезанная, стеклянная пл а- стинка выступает в роли передней стенки резервуара. В месте совм е- щения двух вырезов, между стеклянной пластиной и стенкой, должно быть осуществлено уплотнение, препятствующее вытеканию верхне го буфера. В оба резервуара вмонтированы электроды из платиновой пр о- волоки. При установке в прибор форму с гелем частично погр ужают в буфер нижнего резервуара, так что она опирается на разнесенные по сторонам выступы и ее нижний торец оказывается приподнят ым над дном резервуара. После погружения необходимо удалить пузырьки воздуха.

По окончании электрофореза пластины разнимают, отслаивая одну из них от геля с помощью шпателя. Его всовывают между пласт и- нами со стороны карманов и слегка поворачивают. Со вто рой пластины гель снимают руками и переносят в ванночку для фиксации или окр аски. Необходимо проводить манипуляции в перчатках, т.к. случайное прикосновение кожи рук к рабочей поверхности геля при современных чувствительных методах окрашивания может остави ть на геле артефактное белковое пятно.

Горизонтально расположенные пластины

Преимущество-отсутствие проблемы уплотнения. Оба эле к- тродных буфера находятся в резервуарах, расположенных ниже уровня горизонтального столика, на который кладут гель.

8

Гель, полимеризованный на тонкой стеклянной пластинке или плашке из плексигласа, помещают на столик открытой поверхн о- стью кверху, поскольку препарат вносят не с торца, а в ряд специал ь- ных «колодцев», расположенных на некотором расстоянии от края. Электрофорез проводят в форезных камерах. Препараты вносят в «к о- лодцы» вместе с красителем - бромфеноловым синим, содержащим также глицерин, который «прижимает» краситель и препарат, не позв о- ляя им диффундировать в геле или в буфере.

Пластины для горизонтального элект рофореза в агарозе можно приготовить чрезвычайно просто. На горизонтально установленную (по уровню) плоскость кладут тонкое стекло определенного размера и на него выливают расплавленный раствор агарозы в буфере. Его объем надо рассчитать или подобрать так, чтобы получить пластину нужной толщины. Колодцы для препаратов в этом случае можно и не делать. Фирма LKB рекомендует наносить препараты прямо на поверхность

агарозы через прорези наложенного на пластину специального шаблона со щелями. Препарат объемом 2 — 4 мкл вносят в щель шаблона, откуда он полностью впитывается в агарозу. Впрочем, сравнительно пр о- стое приспособление, смонтированное на столике для заливки, позволяет установить над пластиной (перпендикулярно к ее плоскости) гребенку и с ее помощью при з аливке агарозы образовать колодцы для препаратов. Перед использованием пластину агарозы тоже следует выдержать во влажной атмосфере в течение суток.

Итак, электофорез в агарозном геле позволяет идентифицировать большое количество белковых фракций. Пример – электрофоретическое разделение белков сыворотки крови.

Электрофорез проводят в 1% -ном агарозном геле в мединал - вероналовом буфере рН=8,6 с ионной силой 0,05. Все белки сыворотки крови при рН=8,6 заряжаются отрицательно заряд и движутся от катода к аноду, причем дальше всего уходят альбумины, имеющие меньшую молекулярную массу, затем располагаются 1 -, 2 -, - и -глобулины. Иногда каждая из этих основных фракций может разделиться на н е- сколько подфракций. Первоначальная оценка результатов электрофор е- тического разделения сывороточных белков (выявление нормы или п а- тологии) должна проводиться визуально, путем сравнения с картиной нормальной сыворотки, а количественные данные предназначены тол ь- ко для документирования результатов и динамического наблюдения.

Для электрофореза белков используются различные аппараты, как ручные, так и полуавтоматические. Современные комплексы оснащены микропроцессорными блоками питания и управляются компьютером; в большинстве систем на последней стадии исследования окрашенных мембран или гелевых пластинок (определения относительного колич е- ства белков в каждой фракции) используется электронный цветной ск а-

9

нер или миниатюрная фотокамера, что существенно повышает точность

ивоспроизводимость результатов. Программное обеспечение дает во з- можность усредненного расчета оптической плотности отдельных фракций путем автоматического определения границ "дорожек" и мн о- гократного сканирования каждой из них в нескольких "разрезах", что позволяет исключить ошибки из -за локальных микродефектов и неро в- ного положения носителя, а также до определенной степени нивелир о- вать искривление дорожки и влияние окрашенного фона при неполной отмывке. На экран дисплея и на принтер выводится график - денситограмма с рассчитанным содержанием отдельных белковых фракций. При необходимости маркеры границ фракций на графике можно ско р- ректировать, при этом будет произведен автоматический пересчет их показателей. В компьютере, как правило, создается архив электрофор е- грамм; их можно в любое время извлечь и просмотреть. Электрофорез белков, позволяющий определить их количественные сдвиги и физико - химические характеристики, помогает выявить заб олевания печени и почек, иммунной системы, некоторые злокачественные новообразов а- ния (лейкозы), острые и хронические инфекции, генетически е поломки

идр

Методика электрофореза в агарозном геле.

Для приготовления агарозного геля в СВЧ-печи или на водяной бане расплавляют смесь агарозы, буфера и воды. Охлажденную до 50-60оС смесь тонким слоем заливают в форму и с помощью специальных гребенок делают в геле лунки для нанесения образца. Исследуемый препарат (раствор белка, ДНК или РНК) вносят в лунку, расположенную у края геля - полужидкой среды с сетчатой пространственной структурой (обычно для электрофореза используют тонкие пластины геля). Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым суммарным электрическим зарядом, и когда через гель пропускают электрический ток, они перемещаются в электрическом поле. Молекулы одинакового размера (и одинакового заряда) движутся единым фронтом, образуя в геле дискретные невидимые полосы. Чем меньше размер молекул, тем быстрее они движутся. Постепенно исходный препарат, состоящий из разных макромолекул, разделяется на зоны, распределенные по длине пластинки. За ходом электрофореза следят по перемещению в геле красителя - заряженного низкомолекулярного вещества, которое вносят в каждую лунку перед началом электрофореза. Когда краситель достигает конца пластины, электрофорез останавливают, а гель окрашивают красителем, прочно связывающимся с белками или нуклеиновыми кислотами. Если образец представляет собой дискретный набор макромолекул разного размера, то после электрофореза получается набор четких полос, расположенных одна под другой. Если же распределение молекул по размеру более или менее непрерывно, то получается смазанная картина. По интенсивности окраски полос можно судить о концентрации макромолекул в образце. Чтобы определить относительную молекулярную массу разделенных фрагментов, одновременно проводят электрофорез маркерных макромолекул с известными молекулярными массами. Набор маркеров

10