Способ грама

1. На фиксированный мазок нанести генцианвиолет (бумага по Синеву) на 1-2 мин

2. Краску слить и нанести раствор Люголя на 1 мин

3. Раствор Люголя слить и на мазок нанести 96% спирт на 15-20 мин в зависимости от толщины мазка

4. Спирт смыть дистиллированной водой

5. Мазок дополнительно окрасить разведенным фуксином Пфейффера на 2-3 мин

6. Краситель смыть водой, препарат высушить, промикроскопировать с иммерсией

7. Микроскопия с иммерсией.

Генцианвиолет связывается с пептидогликаном клеточной стенки (рис. №2). Толстый слой пептидогликана грамположительных бактерий связывает много красителя, тонкий слой – грамотрицательных – мало. Раствор Люголя фиксирует краситель за счет образования комплекса – краситель-пептидогликан-йод. При обработке мазка спиртом грамотрицательные микроорганизмы быстро теряют краситель и обесцвечиваются, а грамположительные остаются окрашенными в синий цвет. Дополнительный краситель окрашивает грамотрицательные микроорганизмы в красный цвет

Грамположительные (Гр+) бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет. Грамотрицательные (Гр-) бактерии окрашиваются в красный цвет.

Рис. № 2. Грамотрицательные и грамположительные бактерии

Грамположительные микроорганизмы

Грамотрицательные микроорганизмы

Стрептококки Гр+ кокки, располагающиеся в виде цепочек

Streptococcus piogenes Enterococcus faecalis

Стафилококки Гр+

кокки, располагающиеся в

виде скоплений,

напоминающих

виноградную гроздь

Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis

Бактерии Гр- палочковидные неспорообразующиие микроорганизмы

Esherichia coli Salmonella typhi Mycobacterium tuberculosis

Клостридии Гр+ палочковидные спорообразующие микроорганизмы. Диаметр спор больше поперечника клетки

Clostridium perfringens Clostridium tetani Clostridium botulinum

Вибрионы Гр-

Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus

Правила иммерсионной микроскопии

1. Микроскоп устанавливают в рабочее положение – увеличение объективов

2. Устанавливают освещение, включая лампу или направляя свет на зеркало микроскопа. Конденсор должен быть поднят до упора, диафрагма открыта (рис. №3)

3. На препарат наносят каплю иммерсионного масла

4. Препарат помещают на предметный столик и фиксируют его клеммами

5. Наблюдая сбоку, опускают тубус с объективом 90х, 100х макровинтами в масло почти до соприкосновения с препаратом

6. Затем, глядя в окуляр (7х, 10х), макровинтом очень медленно поднимают объектив до появления изображения и с помощью микровинта производят окончательную фокусировку четкого изображения

7. При микроскопии определяют взаимное расположение микроорганизмов, их размеры, форму, структуру, окраску

8. После просмотра препарата револьвер переводят на малое увеличение 8х и только после этого препарат снимают со столика

9. Фронтальную линзу объектива протирают марлей, смоченной чистым бензином или эфиром для удаления остатков иммерсионного масла

10. Затем опускают предметный столик (или конденсор в микроскопах с неподвижным столиком) и накрывают микроскоп чехлом.

Рис. №3.Рабочие положения микроскопов

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ №2

Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Нильсена.

Студент должен иметь представления:

- этапы развития микробиологии как науки,

- разделы медицинской микробиологии.

Студент должен знать:

- задачи медицинской микробиологии,

- вклад ученых на разных этапах развития,

- основные формы микроорганизмов, их характеристика, примеры,

- главные структуры бактериальной клетки, их функции,

- цель применения и сущность метода Циля - Нильсена, цель подогревания препарата

Студент должен уметь:

- особенности подготовки нативного препарата с мокроты,

- окраска препарата по методу Циля – Нильсена,

-микроскопия окрашенных препаратов с использованием иммерсионной системы,

- соблюдение мер безопасной работы с инфекционным материалом,

- обработка рабочего места и рук дез. веществами.

Этапы самостоятельной аудиторной работы:

1. Подготовить препарат из культуры и окрасить его по методу Циля- Нильсена 2-мя способами

2. Препараты, подготовленные и демонстрационные, промикроскопировать с иммерсией.

3. Обработать рабочие места и руки

4. Зарисовать результаты микроскопирования в дневник