Тема 10. Микроскопические методы исследования

10.1. Понятие микроскопии

Микроскопия – общее название методов получения сильно увеличенных изображений объектов, не различимых глазом человека.

По признаку физической природы сигнала, с помощью которого осуществляют визуализацию малых объектов, различают оптическую, электронную, рентгеновскую, ионную и акустическую микроскопию.

Наименьшее расстояние между двумя точками, начиная с которого их изображение сливаются, называют пределом разрешения (линейным или угловым). В таблице 10.1 приведены пределы разрешения приборов, реализующих разные типы микроскопии.

Таблица 10.1 – Пределы разрешения микроскопов

Прибор	Предел разрешения (δ)
Глаз человека	0,1 мм
Микроскопы:
акустический	0,5 мкм
оптический	0,2 мкм
рентгеновский	50 нм
электронный	0,15–0,3 нм
ионный	0,2 нм
сканирующий атомно-силовой	0,1 нм
сканирующий туннельный	0,001 нм

В оптическом микроскопе реализовано свойство линзы или системы из двух линз давать увеличенные изображения предметов.

10.2. Световая микроскопия

Световая микроскопия обеспечивает увеличение до 2–3 тыс. раз, цветное и подвижное изображение живого объекта, возможность микрокиносъемки и длительного наблюдения одного и того же объекта, оценку его динамики и химизма.

Современные оптические микроскопы предназначены для рассматривания, изучения и измерения микроструктуры клеток, бактерий, срезов тканей, микрокристаллов, волокон, минералов, микросхем и других объектов, размеры которых (менее 0,1 мм) не позволяют наблюдать их невооруженным глазом.

Основными характеристиками микроскопа являются увеличение, разрешающая способность и светосила. Возможности светового микроскопа ограничены волновой природой света. Физические свойства света: цвет (длина волны), яркость (амплитуда волны), фаза, плотность и направление распространения волны – изменяются в зависимости от свойств объекта. Эти различия и используются в современных микроскопах для создания контраста.

Методы микроскопии выбираются и обеспечиваются конструктивно в зависимости от характера и свойств изучаемых объектов.

Метод светлого поля в проходящем свете применяется при изучении прозрачных препаратов с включенными в них абсорбирующими (поглощающими свет) частицами и деталями, например, тонкие окрашенные срезы животных и растительных тканей и т. д.

В отсутствие препарата пучок света из конденсора, проходя через объектив, дает вблизи фокальной плоскости окуляра равномерно освещенное поле. При наличии в препарате абсорбирующего элемента происходит частичное поглощение и частичное рассеивание падающего на него света, что и обуславливает появление изображения. При наблюдении неабсорбирующих объектов сильно рассеивающие непрозрачные элементы, содержащиеся в объекте, поглощают и частично рассеивают падающий на них свет, что обуславливает возникновение изображения.

Разновидностью метода светового поля в проходящем свете является метод косого освещения, который состоит в том, что свет на объект направляют под большим углом к направлению наблюдения. Это помогает выявить «рельефность» объекта за счет образования теней.

Метод светлого поля в отраженном светеиспользуют для наблюдения непрозрачных объектов, например, шлифов металлов. Освещение объекта осуществляют пучком света, отраженным от полупрозрачного зеркала, которое установлено над объективом. Свет проходит через объектив, служащий одновременно конденсором, попа- дает на объект, отражается от него и возвращается, снова проходя через объектив и зеркало, в тубусную линзу. Структура объекта видна из-за различия в отражающей способности его элементов: на светлом фоне выделяются неоднородности, рассеивающие свет.

Метод темного поля в проходящем свете используется в основном для получения изображений прозрачных неабсорбирующих биологических объектов. Изображение в микроскопе формируется при помощи лишь небольшой части лучей, рассеянных микрочастицами находящегося на предметном стекле препарата внутрь конуса и прошедших через объектив.

Темнопольная микроскопия основана на эффекте Тиндаля – обнаружении пылинок в воздухе при освещении их узким лучом солнечного света. В поле зрения на темном фоне видны светлые изображения элементов структуры препарата, отличающихся от окружающей среды показателем преломления. При приготовлении препарата следует избегать наличия пузырьков и крупных частиц. Для темнопольной микроскопии применяют более мощные осветители и максимальный накал лампы.

В основе метода ультрамикроскопии лежит тот же принцип, что и в темнопольной микроскопии. С помощью этого метода можно обнаружить чрезвычайно мелкие частицы. Их изображения представляются наблюдателю в виде дифракционных пятен, размеры которых зависят не от размеров и формы самих частиц, а от апертуры объектива и увеличения микроскопа. Так как подобные частицы рассеивают очень мало света, то для их освещения требуются чрезвычайно сильные источники света (например, угольная электрическая дуга). Ультрамикроскопы применяются в основном в коллоидной химии.

Метод темного поля в отраженном свете применим для наблюдения непрозрачных объектов (шлифы металлов). Последние освещают сверху с помощью расположенной вокруг объектива специальной кольцевой оптической системы – эпиконденсора.

Метод фазового контраста и его разновидность метод «аноптрального» контраста предназначены для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при наблюдении, по методу светлого поля (живые неокрашенные животные ткани). При использовании этого метода световая волна, проходящая через элементы препарата, претерпевает разные изменения по фазе (приобретает так называемый фазовый рельеф). Благодаря применению этого способа микроскопии контраст живых неокрашенных микроорганизмов резко увеличивается и они выглядят темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст).

Фазово-контрастная микроскопия применяется также для изучения клеток культуры ткани, наблюдения действия различных вирусов на клетки и т. п. В этих случаях часто применяют биологические микроскопы с обратным расположением оптики – инвертированные микроскопы. У таких микроскопов объективы расположены снизу, а конденсор – сверху.

Метод наблюдения в поляризованном свете (поляризационная микроскопия) применяется для микроскопического исследования препаратов, включающих оптически анизотропные элементы (многие минералы, зерна в шлифах сплавов, некоторые животные и растительные ткани и др.).

Оптические свойства анизотропных микрообъектов проявляются в зависимости от ориентации этих объектов относительно направления наблюдения и плоскости поляризации света, падающего на них. Наблюдение можно проводить как в проходящем, так и в отраженном свете, пропущенном через поляризатор. При последующем прохождении света через препарат или отражении от него поляризация света меняется, что позволяет судить об основных оптических характеристиках анизотропных микрообъектов (силе двойного лучепреломления, количестве оптических осей и их ориентации, вращении плоскости поляризации, дихроизме).

Метод интерференционного контраста (интерференционная микроскопия) состоит в раздваивании луча, входящего в микроскоп. Один из полученных лучей направляется сквозь наблюдаемую частицу, другой – мимо нее по той же или дополнительной оптической ветви микроскопа. В окулярной части микроскопа оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. Как и фазово-контрастная микроскопия, этот метод дает возможность наблюдать прозрачные и бесцветные объекты и применяется для изучения живых тканей и клеток.

Метод исследования в свете люминесценции (люминесцентная мик- роскопия, или флуоресцентная микроскопия) состоит в наблюдении под микроскопом зелено-оранжевого свечения микрообъектов, которое возникает при их освещении сине-фиолетовым светом или невидимыми глазом УФ-лучами.

Для изучения свойств органических или неорганических веществ с использованием явления флюоресценции с возможностью флюоресцентного исследования только в отраженном или проходящем освещении используют флюоресцентный наноскоп. Это специализирован- ная оптическая система для получения увеличенных изображений малых объектов двух- и трехмерного изображения 3D с разрешением 1–10 нм и регистрации цветного изображения при прокраске различными красителями белков, нуклеиновых кислот, липидов. Флюоресцентный наноскоп работает в сочетании эффективности оптического метода микроскопии с элементами компьютеризованного контроля систем микроcкопа.

Метод широко применяют в пищевой промышленности, микробио- логии, микрохимическом анализе и др.

Метод наблюдения в ультрафиолетовом свете. Частицы многих веществ, прозрачные в видимом свете, сильно поглощают УФ-излуче- ние и легко различимы на УФ-изображениях. Последние регистрируют фотографированием с помощью люминесцирующего экрана или электронно-оптического преобразователя – вакуумного фотоэлектронного прибора – для преобразования невидимого глазом изображения объекта в видимое.

Метод наблюдения в инфракрасных лучах позволяет изучать структуру непрозрачных объектов – темных стекол, кристаллов, минералов. Он также требует преобразования невидимого изображения объекта в видимое путем фотографирования или с помощью электронно-оптического преобразователя.

Для визуального наблюдения микроструктуры металлов, сплавов и других непрозрачных объектов в отраженном свете при прямом освещении в светлом и темном полях, а также для исследования объектов в поляризованном свете методом дифференциально-интерферен- ционного контраста предназначен металлографический микроскоп. Шкалы и сетки, входящие в комплект микроскопа, обеспечивают воз- можность количественной оценки микроструктуры объекта по балльным шкалам.